离子交换层析介质的应用.docVIP

离子交换层析介质的应用 离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。 1. 离子交换剂的选择 在进行分离纯化时，要求层析柱具有高负载量、易于操作及使用寿命长等特点，其中分离介质是最主要的影响因素，因此，分离介质的选择尤为重要。 1.1 品种的选择： 应根据被分离纯化目标产物所带电荷的种类、分子的大小、物理化学性质及所处的微环境等因素，选择适宜的离子交换层析介质。对于无机小分子而言，分离介质的选择相对容易，但对于生物大分子就必须考虑更多的因素。 蛋白质等生物大分子是由多种氨基酸所组成的，在不同的pH条件下显示不同的电性，而生物大分子对最适宜的pH环境具有特定的要求，因此，必须首先了解目标蛋白的等电点及适宜的微环境，根据这些条件选择合适的离子交换剂种类。 是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂，主要取决于被分离的物质在其稳定的pH 下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。例如待分离的蛋白等电点为4，稳定的pH 范围为6~9，由于这时蛋白带负电，故应选择阴离子交换剂进行分离。 1.2 骨架的选择： 应根据目标产品的产量、要求达到的纯度及经济价值等因素，选择合适骨架（基质）的离子交换剂。 通用型的聚苯乙烯离子交换树脂具有结构稳定、价格低廉、全交换容量高等特点，适用于如抗生素、有机酸、动物资源或植物资源的有效成分等一般生化制品的提取分离工艺。而对于要求分辨率高、制品纯度高的一些高附加值的基因工程产品，仍需使用纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的生化分离专用介质。 纤维素离子交换剂价格较低，但分辨率和稳定性都较低，适于初步分离和大量制备。葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH 变化有较大改变，影响分辨率。琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好，分辨率也较高，但价格较贵。 理想的分离介质应该不但易于吸附，还要易于洗脱，如果目标产物对于离子强度和pH值的变化不敏感，可以考虑采用高电荷密度的强酸性或强碱性的强型介质。如果对这些因素比较敏感，则应采用弱酸性或弱碱性的弱型介质。如果大分子物质被吸附后，结合比较牢固，往往难以洗脱，采用苛刻的条件又容易引起大分子的变性，则应选用功能基团密度低的介质。 强酸性或强碱性的强型介质，适用的pH 范围广，常用于分离一些小分子物质或在极端pH 下的分离，但由于电性较强，有时易使一些敏感的生物分子变性或失活。弱酸性或弱碱性的弱型介质，其选择性有较大的范围，且不易使蛋白质失活，故一般适用于分离蛋白质等大分子物质，但其适用的pH范围较窄。 1.3 粒径的选择： 分离介质粒径的大小对离子交换层析柱的分辨率和流速有明显的影响。一般来说分离介质的粒径小，分辨率高，但平衡离子的平衡时间长，流速慢；粒径大则柱的流速较快，压降小，但分辨率低，负载量也较小。所以大颗粒的分离介质适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离，而小颗粒的分离介质适合于需要高分辨率的精细分离或产品的精制阶段。 2. 操作中注意事项 2.1 预处理： 在离子交换剂的工业产品中，常含有少量的有机低聚物及一些无机杂质，在使用初期会逐渐溶解释放，影响目标产品的质量。因此，工业级离子交换剂在使用前必须进行预处理。 通用型的离子交换树脂通常使用酸、碱进行处理，可采用1~2 mol/L的盐酸及氢氧化钠溶液，以4~6倍树脂床体积交替进行处理，在酸及碱处理之间须用去离子水洗至中性。对于大孔型的树脂，还需要用乙醇、丙酮等有机溶剂进行处理，以除去生产过程中所用的有机物残余物。对分离介质进行预处理，不但能提高其工作容量，更可提高被分离产品的纯度。经预处理后的树脂，最后应转为分离过程中适用的离子型态。 对于生化专用的离子交换剂，以多糖类骨架为主的介质，一般贮存在20%的乙醇中。为了分离介质在分离过程中尽量减少pH值的变化，需要用大量的去离子水进行清洗，然后用缓冲液进行平衡。 分离介质的预处理可以在柱内进行，也可以在烧杯等容器中进行。在柱内进行预处理时，或溶液体系改变及操作温度变化时，经常会出现气泡，尤其在使用内径较小的柱时。气泡一经出现，必须及时清除，否则对层析工艺有明显的影响。 2.2 缓冲液平衡介质： pH值是离子交换层析的操作中的一个重要因素，而pH的稳定及改变通常是用缓冲液来实现的，所以缓冲液的选择是影响分离效果的重要因素。 在选择缓冲液时，pH和离子强度是两个关键性的因素，它不仅影响到分离介质对目标产物与杂质的分离效果，而且还影响到产品的收率。选用的pH值取决于目标产物的等电点、稳定性和溶解度，不但要使被分离的物质成为可以进行交换的离子，还要维持其较高的活性。同时也应