蛋白质的定量分析：BCA法.pptVIP

主要内容 一.实验目的 二.实验原理 二.实验原理 三.实验操作 实验结果记录 四.注意事项 思考 一、蛋白质的相关理论知识 2、蛋白质的紫外吸收 3、蛋白质的呈色反应 实验报告 每个大组一份完整的实验报告 名称 组员 【实验目的】 【实验试剂及仪器】 【实验原理】 【实验步骤】 原始记录 【实验结果】 【实验讨论】 每个小组(2个人)写一份结果和讨论 格式如下: 组员 名称 原始记录 实验结果 讨论 * * * * 蛋白质定量分析：BCA法 实验二 一.实验目的 二.实验原理 三.实验操作 四.注意事项 五.蛋白质定量分析方法 1、学习BCA法测定蛋白质浓度的原理及操作； 2、掌握722型分光光度计、移液管的正确使用、试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法计算蛋白质的浓度； 3、了解蛋白质含量测定的多种方法。 OH- +2BCA 螯合物（紫蓝色） 562nm A值 标准曲线法 M待测 蛋白质 + Cu2+ Cu+ C待测 紫蓝色 562nm A待测 含量（ug） A M待测 BCA法测定蛋白质含量的标准曲线 仪器型号:722型分光光度计 作图人:徐先林 时间:2012年9月11日 实验材料 1、器材 722型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管 2、试剂 （1）试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒 石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体 混合后调pH至11.25。 （2）试剂B：4%硫酸铜。 （3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2mL，混合。 （4）蛋白质标准液：0.3mg/mL的蛋白质标准液。 （5）待测样品。 管号 试剂（ mL ） 空白管 1 2 3 4 5 测定管 标准蛋白溶液 （ 0.3mg/ml ） — 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 — 蒸馏水 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 — — 待测样品 — — — — — — 0.5 BCA 工作液 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 蛋白质含量 ug 30 60 90 120 150 表1 BCA法测定蛋白质含量 数据有改动 将上述各管混匀后于37°C保温30分钟，用562nm 波长比色测定吸光度值。 空白管？ 1-5号管？ ？ 水浴锅 1、以牛血清蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐 标，绘制标准曲线。（有兴趣的同学可以学习excel中绘制标准曲线） 2、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量M,再计算出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。 C= M V —— ×250 吸光值(A) ？ 150 120 90 60 30 0 M(ug) 测定管 5 4 3 2 1 空白管 管号 测定三次求平均值 1、实验分组，两人一组 2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染 3、准确量取试剂，正确使用吸量管 4、正确操作722型分光光度计，此次由于溶液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗 5、正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、作图人、时间等 6、实验原始记录书写规范，三线表 一 五.蛋白质定量分析方法 BCA法 二 Folin-酚试剂法 三 紫外线（UV）吸收法 四 五 考马斯亮蓝结合法 凯氏定氮法 六 双缩脲法 蛋白质元素组成特点 紫外吸收特性 呈色反应 不受去污剂、尿素等的影响 肽键和碱性Cu2＋形成紫色络合物 较快 最高 BCA法 强碱性缓冲液 TritonX-100;SDS G-250与蛋白质结合物在595nm的光吸值 快速 高 考马斯亮蓝法 甘氨酸 硫醇 双缩脲反应；酚试剂被还原 费时 高 Lowry法 硫酸铵；Tris缓冲液 某些氨基酸 肽键和碱性Cu2＋形成紫色络合物 中速 低 双缩脲法 非蛋白氮 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 费时 低 改良凯氏定氮 核苷酸 酪氨酸和色氨酸在280nm的光吸收 快速 较低 紫外线吸收法 干扰物