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* 将已变性的样本混匀，吸取75 ul 于“杂交微孔板”中 20-25℃孵育10分钟 加入25 ul 高危HPV探针于微孔板中 65℃孵育60分钟 置于Rotary Shaker I中，1100 rpm，3±2分钟 准备HPV 探针混合物 HC2操作步骤-杂交 将杂交产物转移至“捕获微孔板”相应的小孔中 20-25℃孵育30-45分钟 20-25℃孵育60分钟， 1100 rpm 加入75 ul Detection Reagent 1（碱性磷酸酶偶联的抗体） 于“捕获”微孔板相应的小孔中 HC2操作步骤-抗体捕获及酶标 洗涤微孔板：采用Automated Plate Washer I 或进行手动洗板，重复洗6次 加入75 ul Detection Reagent 2 （化学显色底物） 于“捕获”微孔板相应的小孔中 20-25℃孵育15-30分钟 采用Digene microplate luminometer (DML2000)读数 HC2操作步骤-洗板及化学显色 HC2如何进行结果判读? 1.阴性对照 每次实验必须同时做3份阴性对照。阴性对照的结果必须为10-250 RLU（相对光单位）。变异系数（%CV）应该≤25%，如果＞25%，那么去掉偏离平均值最远的一个阴性对照，用剩下的两个阴性对照计算平均值以及变异系数。 %CV必须≤25%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告 2.标准品 每次实验必须同时做3份高危HPV标准品。 %CV应该≤15%，如果＞15%，那么去掉偏离平均值最远的一个标准品，用剩下的两个标准品计算平均值以及变异系数。 %CV必须≤15%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告 3. 用标准品平均值（MHRC）以及阴性对照平均值MNC计算MHRC/ MNC比值.2.0≤MHRC/ MNC ≤15。如果＜2.0 或＞15，本次实验结果无效，必须重做。 4. 如果符合以上的标准，检测结果是可靠的。此时的Cutoff值（阳性标本评判的标准）就是MHRC 阴性对照 （NC） 高危HPV标准品(HRC) 97 312 101 335 91 307 平均值 96 318 %CV 4.9 4.7 HRC/ NC 3.31 Cutoff 值=318， 所有标本的相对光单位（RLU）应该转换为与Cutoff值的比值， 比值大于1为阳性，比值小于1则为阴性 结果的判定 质控 对照 HPV 基因型 预期的结果（RLU/Cutoff值） 最小值 最大值 QC1-LR HPV 6 0.001 0.999 QC2-HR HPV 16 2 8 3份阴性对照，3份高危HPV标准品，2份质控，共需额外消耗8人份试剂！ HC2-定性检测 以上为FDA 批准的说明书中内容截图 HC2技术总结 原理：采用核酸分子杂交，抗体捕获（吸附杂交体），化学显色 不分型 不能检测HPV多重感染 不定量 有交叉杂交反应 手动操作很多，步骤繁琐 每次实验要额外消耗8人份试剂，试剂成本高 需基因杂交信号放大系统，设备成本高 项目 基因芯片（亚能） HC2 技术原理 PCR+反向点杂交+化学显色 分子杂交＋抗体捕获+化学显色 是否分型 分型，确定具体的基因型 不能分型，仅提示是否有HPV感染 检测HPV种类 检测23种HPV基因型，18种高危，5种低危 检测13种高危型 标本类型 宫颈脱落细胞、疣体组织、病理石蜡切片，液基细胞学标本 宫颈脱落细胞，液基细胞学标本 灵敏度 高（1000 copies/mL） 低（100000 copies /mL） 交叉杂交 无 有 基 本 设 备 离心机、普通PCR仪、普通杂交仪（价格低廉） 基因杂交信号放大系统 （价格昂贵） 检测成本 可单人份使用，一次可检测标本量96个或更多 每次实验需额外消耗8人份试剂，试剂成本高 亚能HPV产品与HC2的比较优势 能分型 检测23种HPV 基因型 可检测更多来源的标本 无交叉杂交反应，特异性高 通用仪器设备，如PCR仪和杂交仪 检测成本低 careHPV Test 定性检测14种高危型 HPV 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68 产品名称：高危型人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测试剂盒 方法：杂交捕获-化学发光法 商品名： careHPV Test 该检测技术专为缺少水、电或现代化实验室等基础设施落后的临床环境设计， 便于携带、易于使用，当日可出检查结果 careHPV识别宫颈癌与高度病变的敏感度和特异度，都大大优于醋酸染色后观察法 HPV 检测 HPV DNA 检测 HPV E6，E7 mRNA 检测 分型 不分型 部分分型 方法 代表厂家 PCR-反向点杂