酶联免疫检测法概述.docVIP

酶联免疫检测法概述 酶联免疫法，简称ELISA。它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。ELISA技术自本世纪70年代出现开始，就因其高度的准确性、特异性、稳定性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等优点，作为基础免疫技术，在疾病诊断与控制、食品卫生、环境保护、农业育种等领域中倍受重视，成为检验中最为广泛应用的方法之一。本文将从基本原理、检测方法和应用三方面简要介绍酶联免疫检测法。 一、酶联免疫法的基本原理： 酶联免疫法的基本原理是⑴：通过化学的方法将酶与抗体或抗原结合起来，形成酶标记物；或通过免疫学的方法将酶与抗酶抗体结合起来，形成免疫复合物。这些酶标记物或免疫复合物仍保持其免疫活性，然后它与相应的抗原或抗体其反应，形成酶标记的或酶的免疫复合物。因此ELISA既可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。常用的标记酶有：①碱性磷酸酯酶，底物通常为4-硝基苯酚磷酸酯；②辣根过氧化物酶，底物有邻苯二胺、邻联甲苯胺、邻联茴香胺、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺等；③青霉素酶，以青霉素G为底物；④β-D-半乳糖苷酶等。而影响ELISA灵敏性和准确性的因素主要有：抗原包被、非特异性反应、酶和抗体的偶联、酶的底物、洗涤等。 二、酶联免疫检测方法及改进： 酶联免疫技术的改进主要通过四个层面完成⑵：①包被抗原技术，②酶联免疫的灵敏性，③酶联免疫的特异性，④统一ELISA操作方法。 常规酶联免疫检测方法有双抗体夹心法测抗原和间接法测抗体。 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，本法首先用特异性抗体包被于固相载体,利用待测抗原上的两个抗原决定簇分别与固相载体上的抗体和酶标记抗体结合,形成抗体-待测抗原-酶标抗体复合物,复合物的形成量与待测抗原含量成正比⑸。由于加了一层抗体，因此它具有更高的灵敏性。其实现主要步骤有：⑴将特异性抗体包被固相载体。⑵加待检标本。⑶加酶标抗体。⑷加底物显色。 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。⑵加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。⑶加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。⑷加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 为了提高检测灵敏度，酶联免疫常规的检测方法有所改进，主要有⑶：小分子夹心ELISA，双抗原夹心ELISA测定抗体，组合单克隆抗体夹心Dot-ELISA测抗原，同步ELISA测定多种抗体，模块法（blocking ELISA）测抗体等。目前还开展了新的测定方法⑷：双位点一步法，捕获法测IgM抗体，亲和素－生物素的ELISA，斑点酶联免疫吸附试验，NC膜微粒ELISA，磁颗粒ELISA，酶联免疫荧光测量法（ELIFA），免疫印迹技术与层析－ELISA等。 其中，双位点一步法是在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 捕获法测 IgM抗体的原理是：血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。 酶联免疫荧光测量法又称点免疫结合法或抗原斑点试验,是Hawkes等参照核酶的斑点杂交法改良而成的,是以纤维素膜为载体的一种新型免疫检测技术⑹。该技术在孔硝酸纤维素ELISPOT96微量板上进行的，先行微量板包被可包特异性抗原以检测抗体生成细胞或被单克隆捕获抗体以检测特异性CK泌细胞 后者称反向 (ELISPOT revers) ⑺。 此外，在使用酶联免疫技术时还要注意几个问题：1 试剂盒的选用；2 临界值(cut-off)的确定；3 检测限的测定；4 酶联免疫检测方法验证等⑻。 三、酶联免疫技术的应用： 目前，酶联免疫技术被广泛应用到了许多领域，其中医学检验是最主要的领域之一。ELISA在医学中的应用主要