分子生物学与生物化学实验操作设计与技能(6-1)(1).pptVIP

分子生物学与生物化学实验操作、设计与技能 转化技术(二) 李刚 副教授 植物遗传转化方法 PEG 法 3 农杆菌介导转化法 1 电击法 4 基因枪法 2 植物遗传转化方法 花粉管通道法 7 显微注射法 5 碳化硅纤维法 8 脂质体法 6 植物遗传转化方法 超声波法 9 激光微束法 10 农杆菌介导的遗传转化机理 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌,用于基因操作的主要有两类：根癌农杆菌（A. tumefaeiens）和发根农杆菌（A. rihizogenes）。他们分别含有Ti质粒和致根Ri质粒，，目前对Ti质粒的研究较详细而且应用广泛。Ti质粒根癌农杆菌在感染植物时，能将其环状Ti质粒上的一段DNA插入到被感染植物基因组中，并能稳定遗传给后代，导纳细菌本身不进入被感染的植物细胞，由此发展出农杆菌Ti质粒为载体的植物遗传转化系统。这是自然界存在的一个天然的遗传转化系统。 农杆菌转化的主要过程为（1）细菌在植物敏感细胞上吸附；（2）农杆菌中的Ti质粒上的Vir区基因被激活；（3）T－DNA切割和T－DNA复合物形成；（4）T－DNA复合物由农杆菌进入植物细胞；（5）T－DNA整合到植物染色体上并且进行表达。 自然状况下，普通农杆菌能够感染双子叶植物、裸子植物和少数几种单子叶植物。近年来，农杆菌在真菌、裸子植物和单子叶植物转化方面取得了可喜的进展，其中以单子叶植物，尤其是禾谷类作物的成功转化最引人注目。 实现农杆菌对单子叶植物成功转化的关键因素包括（1）选择活跃分裂的功能细胞；（2）添加酚类化合物，促进Vir基因的活化；（3）合适的农杆菌菌株（载体），如LBA4404，EHA101及C58等；（4）选择合适的基因型、培养基、适宜的菌液浓度、细菌的生长状态等均是转化能否成功的关键所在。 基因枪法 又称微弹轰击法。其基本原理是：将外源DNA包被在微小的金粒子或钨粒子表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。 现在基因枪法已成为继农杆菌介导法之后第二大植物遗传转化方法，因为其具有以下优点： 受体类型广泛；无物种限制，操作简便快速；可控度高，转入组织的深度可用轰击压力和空间距离来控制；可同时用几个质粒进行共转化。 缺点：转化频率低、价格昂贵、整合过程中易发生重排和高拷贝插入现象及后代遗传不稳定等缺点。 PEG法 PEG即聚乙二醇，是一种多聚化合物，能够促进植物原生质体直接吸收外源质粒DNA。PEG通过电荷之间的相互作用与DNA形成紧密复合物，原生质体通过内吞作用吸收外源复合物到细胞内。PEG介导基因转化法由Davey等于1980年首创，PEG法对禾本科作物有重要作用，应用PEG法已成功转化了小麦、水稻、玉米、高梁等多种单子叶禾谷类作物的原生质体。由于原生质体不易形成再生植株，且PEG法转化率低，因此PEG法至今尚未普遍应用。 电击法（Electroporation） 电击法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电击穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。李宝健等于1985年首次将其应用于植物细胞的基因转化，现已被广泛应用于单子叶、双子叶植物中，特别对禾谷类作物更有发展潜力。 显微注射法 是利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞质或细胞核中。受体细胞的固定是显微注射中的一个重要问题。显微注射用的微针极细，针尖直径以0.5??m左右为宜，一次注入细胞质中的DNA量约为105／ml.该方法转化效率高，适用于各种材料。在多种植物的原生质体转化率高达60％以上，如烟草、油菜、苜蓿等。 脂质体法 是根据生物膜的结构特性，利用脂类化学物质人工合成细胞膜，然后用其将外源基因包裹形成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用，将外源DNA转入受体细胞。朱祯等（1990）首次利用这一技术将人的?-干扰素cDNA导入水稻原生质体获得转基因植株。 花粉管通道法 此法是由我国的周光宇等（1983）建立并发展起来的。主要原理是授粉后使外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞，可用于任何开花植物。1983年周光宇等利用此法将外源DNA成功导入棉花.目前该技术已在小麦、棉花、蔬菜作物中有报道。花粉管通道法是一种直接简便的转化方法，不需要组织培养的继代，从而排除了植株再生的障碍，是一种应用广泛的外源DNA直接导入技术。 碳化硅纤维法 应用直径为0.6?m、长度为10-80 ?m的碳化纤维，使附着于纤维或细胞壁上的质粒DNA借助于在涡旋引起的相互碰撞过程中纤维对细胞的穿刺作用而导入细胞。该方法简单、快速、成本低，且受体类型广泛。 超声波法 是一种新的外源DNA导入方法，其基