分子印迹(渍)与分子杂交技术.pptVIP

分子印迹（渍） 与分子杂交技术 印迹（渍）技术 Southern Blot－－DNA（由Edwin Mellor Southern 等人首次应用） （1975年，Southren创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜（NC膜）上，再进行杂交的方法，被称为Southren印迹法。） Northern Blot－－RNA （Alwine等将类似方法用于RNA印迹，被戏称为 Northern印迹。） Western Blot－－Protein（immunoblotting) （1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为Western印迹，这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低电压完成转移。） 固相核酸印迹杂交类型 Southern印迹杂交（ southern blot ） Northern印迹杂交（Northern blot） 斑点杂交（Dot blot） 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization） 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置 WESTERN BLOT 分子杂交技术Hybridization technique （ 在DNA与DNA，DNA与RNA之间，存在着碱基互补的关系，在加热或加入变性剂等条件下，DNA双链之间的氢键被破坏，双链解开成为单链，此时加入有互补序列的DNA或RNA，在一定离子强度和温度下保温，则加入的DNA或RNA可与模板链形成稳定的DNA-DNA或DNA-RNA异源双链，此过程称为杂交。） 核酸分子杂交的基础 不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链 核酸分子杂交的原理 分子杂交技术的发展 1961年，Hall等探针与靶序列在溶液中杂交1962年，Bolton等设计DNA-琼脂技术 60年代中期Nygaard 等研究应用硝酸纤维素（NC）膜 70年代到80年代早期，随分子生物学技术进展，核酸杂交技术有了突破性进展 应用：目前核酸杂交技术与其它技术相结合广泛应用于特定基因的表达、基因定位、遗传病的检测、组织病理学的研究、生物分类方面。 理想的寡核苷酸探针应具备的条件 长18－50nt, 较长探针杂交时间较长，合成量低；较短探针特异性会差些 碱基成分：G＋C含量为40％－60％，超出此范围则会增加非特异性杂交 探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构 避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如－GGGGG 一旦选下某一序列符合上述标准，最好将该序列与核酸库中序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70％或有连续8个或更多碱基的同源，否则，该探针不能用 缺口平移法(nick translation) DNA快速末端标记 随机引物法 聚合酶链式反应法 化学标记技术:直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上 探针标记物应具备的条件 (探针（probe)是指能与特定的靶分子发生特异性结合并能以特殊的方法被探知的分子.) 高度灵敏性 标记物与探针的结合不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化特性 esp.Tm值 用酶促方法进行标记时酶的活性应不受影响 检测应具有特异性 标记物 放射性同位素 1）灵敏度极高，可以检测10-14~10-18 g 的物质。最适条件下，可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。 2） 放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，对酶促反应无任何影响，不会影响碱基配对的特异性、稳定性和杂交性质。 3）特异性高，假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。 其缺点是： 1）放射性污染。 2）过强的放射线可以造成核酸分子结构的破坏。 3）半衰期短，标记后立即使用（32P/14.3d 35S/87.1d 3H/12.1y ）。 非放射性探针标记的显色体系 AP显色体系：　　　　 AP BCIP BCI-OH + NBT→紫色↓ BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸，NBT：四氮唑蓝 HRP显色体系： HRP·H2O2? DAB–2NH2 棕色↓+ 2H+ +H2O ABC显色体系： DNA –B + SA – AP→DNA – B – SA-AP或DNA – B +SA - BAP→DNA –B –SA –BAP 经上述两反应，把AP连接在DNA上以后，再进行AP酶显色。 SA为Streptavidin（链霉亲合素），BAP为生物素化的