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基 因 工 程 基因工程的概念： 利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程. 基因工程(gene engineering)常和以下名称混用 遗传工程(genetic engineering); 基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(gene manipulation); 重组DNA技术(recombination DNA technique) 1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。 2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子 3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。 4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。 5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。 6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 第一节　重要的工具酶 一、限制性核酸内切酶 二、DNA聚合酶 三、逆转录酶 四、DNA连接酶 五、碱性磷酸酶 六、末端脱氧核苷酸转移酶 二、DNA聚合酶 (一)DNA聚合酶I ①催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针； ②第二条cDNA链的合成； ③对DNA3‘突出末端标记； ④DNA序列分析。 (二)Klenow片段 用枯草杆菌蛋白酶可将DNA聚合酶I裂解为36kD和76kD两个片段，大片段称为Klenow片段.具有5→3聚合酶活性及3→5外切酶活性，而失去了5→3外切酶活性。它具有的3→5外切酶活性能保证DNA复制的准确性，把DNA合成过程中错误配对的核苷酸去除，再把正确的核苷酸接上去。 (三)TaqDNA聚合酶 TaqDNA聚合酶是一种依赖DNA的耐热DNA聚合酶 主要用于聚合酶链反应(PCR)中，能以DNA为模板，以结合在模板上的引物为起点，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从5→3方向合成新的DNA链。TaqDNA聚合酶在70～75oC时具有最佳的生物活性，随着温度的降低，酶活性明显下降。同时此酶缺乏3→5外切酶活性，无校正功能。 三、逆转录酶 以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶称为逆转录酶，合成的DNA产物称为互补DNA(cDNA)。 应用于：①将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；②补平和标记5-末端突出的DNA片段；③代替Klenow酶用于DNA序列分析；④制备杂交探针等。 四、DNA连接酶 DNA连接酶催化双链DNA一端3‘端羟基与另一双链DNA的5’端磷酸基连接，形成3‘,5’-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA末端连接起来。从而把两个DNA分子连接起来，或连接双链DNA中一条链的切口 最常用的DNA连接酶是由T4噬菌体编码的T4 DNA连接酶。 要求：两个双链DNA片段间存在互补的粘性末端或平头末端 第二节　基因克隆常用的载体 概念： 载体(vector)是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接，实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的DNA分子。 常用质粒载体举例 1、pBR322载体 2、pUC载体 1、pBR322载体 优点： 1、分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。 3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。 2、pUC18和pUC19 pUC系列质粒载体具有三个显著特点： （1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700个拷贝）。 （2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用?-互补原理进行蓝白筛选。 （3）多克隆位点区（MCS） 由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切酶会产生不同的粘性末端，可选用两种内切酶组合在质粒载体和外源DNA上产生相同的末端，进行双粘端连接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。 pUC18和pUC19载体 第三节　重组DNA基本原理 1. 目的基因的获取 2. 克隆载体的选择与构建 3. 外源基因与载体的连接 4. 重组DNA导入