Chip实验：证明CEBP和Tmub1启动子或增强子序列的结合.docx

Chip实验：证明C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合 一、实验背景 在IL-6诱导条件下利用CHiP技术提取C/EBP－DNA复合物，以Tmub1基因的碱基序列设计引物，以提取的DNA为底物，进行扩增，从而证明C/EBP结合的DNA含有Tmub1基因，进一步确认C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的相互作用。  二、实验分组 分2个组进行实验普通PCR检测和WB检测（检测Tmub1蛋白表达水平，抗体嘉美实验中心提供。注：嘉美实验中心提供绝大多数常用国外原装进口抗体，为实验委托者节约大量实验经费。） 第一组：A组 第二组：B组  三、实验步骤 转染3天后收集细胞做CHIP-PCR以及WB检测 实验对照：设定的对照有 1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNA Polymerase II） 2、INPUT对照（DNA片段在沉淀以前，收集下来的对照） 3、阴性对照（非免疫IgG血清吸附，Normal Mouse IgG） 细胞转染流程:略 EZ-ChIP?染色质免疫共沉淀实验检测流程（Millipore Catalog # 17-371) 一、试剂盒描述 试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体  二、试剂盒组分 1、试剂盒含有成分 1） Store at 4℃: ChIP Blocked Protein G Agarose，1.5 ml ChIP Dilution Buffer One vial containing，24 ml Low Salt Immune Complex Wash Buffer，24 ml High Salt Immune Complex Wash Buffer，24 ml LiCl Immune Complex Wash Buffer，24 ml TE Buffer，24 ml 0.5 M EDTA，250 ul 5 M NaCl，500 ul SDS Lysis Buffer，10 ml 1 M Tris-HCl pH 6.5，500 ul 10X Glycine，11 ml 10X PBS，24 ml 2） Store at -20℃: Protease Inhibitor Cocktail II（蛋白酶抑制剂），2×110 ul RNase A，600 ug of RNase A in 60 ul sterile water. Proteinase K，600 ug of Proteinase K in 60 ul 1M NaHCO3，600 ul Anti-RNA Polymerase II ，25ug clone CTD4H8. Normal rat IgG 3）Store at Room Temperature: 20% SDS，242 ul of 20% SDS. Spin Filters，One bag containing 22 Spin Filters with Collection Tubes Collection Tubes，22 Collection Tubes. Bind Reagent A ，25 ml of Bind Reagent A. Wash Reagent B，12.5 ml of Wash Reagent B. Elution Reagent C，1.5 ml of Elution Reagent C. 2、抗体及血清 特异性抗体：Anti-CEBP Beta antibody [E299] (ab32358嘉美实验提供) Normal rat IgG  三、 仪器设备 微量混匀器Vortex mixer 震摇器Rotating wheel/platform. 计时器Timer 可调微量加样枪以及tip头，Variable volume (5-1000 ml) pipettes + tips 高速离心机MicrofugeVariable temperature water bath 细胞刮子Cell scraperSonicator 1.5 Ml离心管Microfuge tubes PCR管PCR tubes 引物设计：略 四、CHIP 操作流程 1、细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解 预先准备： 1) 准备细胞，150 mm培养瓶（20ml培养液）密度为80-90%，细胞数量≥1 x 10-7个； 2) 准备42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PB