重组蛋白表达体系.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 07/16/96 * ## * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Ti质粒具有五个主要功能区域: T-DNA、质粒转移、冠瘿碱代谢（Opine Catabolism）、复制原点(ori)和毒性区域(vir) T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其它序列交界处的25bp不完全直接重复，右端的序列称为右界（RB）, 左端的为左界（LB）。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失后，将其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组 Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的 Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，很难用作DNA克隆载体进行操作 Ti质粒特点 第六节 转基因表达 * * 转基因农作物的发展 第一代转基因农作物提高了现有农作物的生产效率，通过减少成本或损失，它们的主要利益体现在农艺学上。迄今为止，最重要的农艺学改善是耐除草剂的特性，由此培育出能耐受特殊化学药剂的商品农作物，使除草剂能被用于杀灭杂草而不对农作物产生不良影响 第二代转基因产品将是那些以消费者直接受益的方式改变产品最终构成的产品。换句话说，它将可能增强产品现有的理想特性(例如强化大米营养)或者加上消费者想要的新的特性 第六节 转基因表达 * * 获益的主要途径有三个： 防止虫害和杂草危害，增加产量 由于减少了杀虫剂和除草剂等农药的用量，降低了生产成本，农民的纯收入相对增加 通过减少农田害虫和杂草防治的工作量，节省劳力成本，相对增加了农民的经济收入 27 转基因植物带来的经济效益 第六节 转基因表达 * * III. 转基因技术 方法：农杆菌介导法、基因枪 转基因技术是将外源DNA导入细胞的一种技术。它是在DNA重组技术的基础上发展起来的 第六节 转基因表达 * * 转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎肝细胞，然后将细胞导入动、 物子宫，使之发育成个体 转基因（Transgene） 被导入的目的基因 转基因动物（Transgenic Animal） 目的基因的受体动物 第六节 转基因表达 * * 增加法：將某一物种抽取个別基因，导入另一动物或植物的基因組內，使其改变表現性狀，例如把抗除草剂的基因导入大豆，令大豆能夠抗除草剂 減少法：使特定动植物基因发生缺失，令动植物丧失某些原有性质与功能，例如减少蕃茄內催熟基因的数量，以延迟番茄的成熟期 调节法：去除或增加某固定基因的控制因子，可以改变生物特性的表現程度，甚至是功能，造成调整生物生命特性，例如透过刺激头发的基因，改变头发的色素 转基因技术原理 第六节 转基因表达 * * 转基因动物技术步骤 选择能有效表达的蛋白质 克隆与分离编码这些蛋白质的基因 选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基因调节序列 把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细胞或小鼠中预先检验其表达情况 把拼接的基因注射到受精卵的细胞核中 把注射后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发 检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达情况以及外源基因在其后代中的传递情况 第六节 转基因表达 * * 转基因导入方法 反转录病毒转染法 磷酸钙沉淀法 脂质体介导法 血影细胞(Blood Shadow Cell)介导法 DNA微注射法 精子载体法 胚胎干细胞（ES）介导法 染色体片段注入法 电转移法等。在转基因动物中，DNA微注射法比较常用 第六节 转基因表达 * * 转基因生物鉴定 外源基因整合的鉴定 染色体和基因水平的检测（1）DNA斑点杂交 （2）Southern印迹杂交 （3）PCR 外源基因转录水平的鉴定 （1）Northern印迹杂交 （2）RNase保护分析 （3）RT-PCR 外源基因表达蛋白的检测 蛋白质水平的检测: Western印迹杂交 报告基因的酶法检测 第六节 转基因表达 * * 核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(Clone) 第六节 转基因表达 * 第十五章 基因工程的应用和前景 * 基因打靶 （Gene Targeting） 概念: 这种技术是通过基因工程的方法通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。这一技术称为基因打靶 若定向敲除某个结构已