间斑寇蛛粗毒的生理生化分析--两种采毒方法的比较1.docVIP

如果您需要更多资料可以到/week114进行免费查阅 间斑寇蛛粗毒的生理生化分析:两种采毒方法的比较1 段志贵，杨静，晏晓军，曾雄智, 王贤纯, 梁宋平 湖南师范大学生命科学学院，长沙 （410081） E-mail: HYPERLINK mailto:wang_xianchun@263.net wang_xianchun@263.net; HYPERLINK mailto:liangsp@ liangsp@ 摘 要：利用两种不同方法采集间斑寇蛛毒液并对其进行理化和生物学性质的比较分析。结 果显示，粗毒中的蛋白质成分主要是分子量较大（10 kDa）的酸性蛋白质。与毒囊粗毒相 比，电刺激粗毒中分子量在 100 kDa 左右的蛋白质含量明显高于毒囊粗毒中的含量，而两者 中分子量较小（10 kDa）的蛋白质和多肽的组成非常相似。电刺激粗毒和毒囊粗毒对小白 鼠的 LD50 值分别为 0.16 mg/kg 和 0.39 mg/kg 体重；对美洲蜚蠊的 LD50 值分别为 1.87μg/g 和 2.32μg/g。在浓度为 3.2×10-6 g/ml 时,电刺激粗毒能在 25.0±2.2 min 内完全阻断小属膈神 经-膈肌标本的神经肌肉接头传递;毒囊粗毒在浓度为 6×10-6 g/ml 时的完全阻断时间为 23.3±2.2 min；粗毒中的低分子量（10 kDa）部分在 1×10-4 g/ml 浓度下对标本的神经肌肉接 头传递无明显影响。上述结果表明，间斑寇蛛毒液是一种富含大分子量蛋白质的混合物；哺 乳动物神经毒性主要基于其中的大分子量酸性蛋白成分而不是低分子量的多肽；电刺激粗毒 中的活性成分与毒囊粗毒中的相似，但含量高于毒囊粗毒。 关键词：间斑寇蛛；粗毒；粗毒采集；性质；比较分析 中图分类号：Q51 1. 引言 间斑寇蛛（L. tredecimguttatus）（俗称“黑寡妇”蜘蛛）毒液是由多种活性成分组成的混 合物，是间斑寇蛛捕获猎物和防御敌害的有效武器。在过去的几十年中，间斑寇蛛因频繁引 发伤害人、畜的事件及其毒液中大量具有药用前景的生物活性成分的存在而引起了人们的广 泛关注[1,2]。研究间斑寇蛛毒液的组成和性质对于阐明蛛毒中毒的机理、防治蜘蛛伤害及活 性毒素成分的开发利用均具有重要的意义。将毒腺匀浆应用于龙虾神经-肌肉标本时，发现 它能先增强然后减弱兴奋性和抑制性突触后电位，表明粗毒中含有作用于龙虾神经肌肉接头 突触前膜的成分[3,4]。将毒腺匀浆应用于青蛙神经-肌肉标本时，发现它能够导致小终板电位 频率的增加及神经末端突触囊泡的减少[5,6]。迄今为止，已从间斑寇蛛毒液中分离鉴定到包 括 Latrotoxins 在内的 7 种主要的毒性成分。所有研究过的 Latrotoxins 类毒素是一类大分子 酸性蛋白质，分子量范围分布在 110-140 kDa 之间，等电点分布在 5.5-6.0 之间；能导致神经 末端递质分泌的显著增加，且对脊椎动物、昆虫或甲壳类动物有着不同的专一性[1]。其中被 研究得最多的是 alpha-latrotoxin, 在有或无 Ca2+的条件下都可以通过诱导突触递质的大量释 放而对脊椎动 物产生致命的影响 [5, 6-11] 。 此外， Akhunov 等人 [12,13] 对间斑寇 蛛 （L.tredecimguttatus）毒液中的激酶和两种具有血管舒缓激肽增效作用的多肽进行了研究。 他们确定了这种激酶是一种巯基内肽酶，这种酶能够催化切断肽内的脯氨酸羧基端的肽键。 而对大鼠的实验结果表明，两种血管舒缓激肽增效多肽能够延长血管舒缓激肽的抑制作用、 刺激细胞释放组氨酸和降低血压。Volkova[14]等人从间斑寇蛛粗毒中分离出了两种低分子量 蛋白质 LMWP 和 LMWP2，实验证明这两种物质对脊椎动物和蜚蠊（Periplaneta Americana） 均无毒性。 在蜘蛛毒素研究中，毒液采集是重要的第一步。然而由于间斑寇蛛的个体较小，给采毒 带来一定困难。在间斑寇蛛毒素研究的早期，使用最多的毒素采集方法是分离蜘蛛毒腺后进 1 本课题得到国家自然科学基金30670640 ），教育部高等学校博士学科点专项科研基金 （20050542003）和湖南省教育厅基金（06C503）的资助。 行匀浆提取[14-18]。尽管现在许多研究者更趋向于使用电刺激方法来采集毒液[19-22]，但从离体 毒囊中抽提毒素的方法由于其操作简单而仍被经常采用。本文利用电刺激和和分离毒囊两种 方法采集间斑寇蛛毒素，系统分析粗毒的理化和生物学性质并对两种采毒方法进行比较。 2. 材料和方法 2.1 材料 三氟乙酸（TFA）、α-氰基-4-羟基苯丙烯酸（HCCA）、芥子酸（SA）、乙