顺乌头酸酶（ACO）活性检测试剂盒说明书微量法100管96.PDFVIP

顺乌头酸酶（ACO ）活性检测试剂盒说明书 微量法 100 管/96 样 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测 定测定意义 顺乌头酸酶（aconitase ），三羧酸循环中的酶，催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不 易氧化，在顺乌头酸酶作用下，通过脱水与加水反应，使羟基由 β碳原子转移到 α碳原 子上，生成易于脱氢氧化的异柠檬酸，为进一步的氧化脱羧反应作准备。 测定原理 ACO 催化柠檬酸转化成异柠檬酸，异柠檬酸氧化脱羧将 NAD+ 还原生成 NADH ，导致 340nm 处光吸收上升。 需自备的仪器和用品 紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制 试剂一：100mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂二：20mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂三：1.5mL×1 支，-20℃保存； 试剂四：液体 20mL×1 瓶，4 ℃保存； 试剂五：液体 5mL×1 瓶，4 ℃保存； 试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加 1.5mL 蒸馏水充分溶解；现配现 用试剂七：粉剂×1 支，4 °保存；临用前加 12mL 试剂四充分溶解； 工作液：临用前在 12mL 试剂七中加入 1mL 蒸馏水、1mL 试剂四、1mL 试剂五、1mL 试 剂六充分混匀 样本的前处理： 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 1、称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器 或研钵匀浆。 2 、将匀浆转入离心管内 600g，4 ℃离心 5min 。 3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4 ℃离心 10min。 4 、上清液即胞浆提取物，可用于测定胞质顺乌头酸酶活性。 5、在步骤④的沉淀中加入200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20 ％或 200W ，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。 测定步骤 1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、样本测定 （1）将工作液，置于37℃ （哺乳动物）或25 ℃ （其它物种）水浴10min；现配现用；若 分次用将工作液分装后于-20°保存，一星期内可用。 （3 ）在微量石英比色皿或96 孔板中加入 40 μL 样本 160 μL 工作液，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 3min20s 后的吸光值 A2 ，计算ΔA=A2- A1 。ACO 活性计算 a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1） 按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活性单位。 9 ACO 活性（nmol/min/mg prot ）＝[ΔA×V 反总÷ （ε×d ）×10 ]÷(Cpr×V 样) ÷T=268×ΔA÷Cpr （2 ） 按样本鲜重计算 单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活性单位。 9 ACO （nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷ （ε×d ）×10 ]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=54×ΔA÷W （3 ） 按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活性单位。 ACO 4 9 活性（nmol/min/10 cell ）＝[ΔA×V 反总÷ （ε×d ）×10 ]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.108×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L ；ε ：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm ；d ： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.04 mL ；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL ； T ：反应时间，3min ；Cpr ：样本蛋白质浓度，mg/mL ；W ：样本质量，g ；500：细菌或细胞 总数，500 万。 b