生物化学基本实验技能训练（二） 721E型分光光度计的原理和使用方法.pptVIP

生物化学基本实验技能训练（二） 721E型分光光度计的原理和使用方法 实验目的 1、掌握721E分光光度计的原理、结构与操 作方法 2、学习末知溶液的浓度测定方法 3、制作CuSO4标准曲线，求得未知CuSO4溶液的浓度 主要内容 分光光度法的原理 吸光度的测量 定量分析方法 721E分光光度计的操作方法 721E分光光度计操作练习 分光光度法 问题：如何测定溶液中某一种物质的浓度？ 提示(酸碱滴定、氧化还原、络合滴定、沉淀等) 光分析：经历了目视比色、光电比色和分光光度法几个不同阶段。 分光光度法：利用溶液对单色光的吸收度来确定溶液中有色物质的含量 有色物质溶液颜色的深浅与其浓度有关，浓度愈大，颜色愈深 光的基本性质 光是一种电磁波，具有波动性和微粒性。 波长(λ)、频率(υ)和光速(c)之间的关系是 υ=c/λ 电磁波谱图 可见光区：波长范围约为380~760nm 近紫外光：280~380nm 物质对光的选择性吸收 问题：歌舞厅内彩色球灯旋转时，你看到物质颜色发生什么变化？ 结论： 物质对光的吸收具有选择性，同一种物质对不同波长的光的吸收能力不同，不同物质对同一波长的光的吸收能力也不同 物质所呈现的颜色正是它对不同波长光选择性吸收产生的在人视觉上的反映 溶液的颜色 当白光通过某一溶液时，该溶液会选择性地吸收某些波长光而让那些未被吸收的光透射过去，溶液呈现透射光的颜色。 被吸收的光与透射过去的光称为互补色光 吸收曲线 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即可得到一条吸光度随波长变化的曲线，称之为吸收曲线或吸收光谱。 光吸收程度最大处的波长，称为最大吸收波长，常用λmax表示。 在正常情况下，选用不同浓度的某种溶液，最大吸收波长是固定不变的。 透光率与吸光度 透光率(Transmittance， T) T=It/I0×100％ 透光率的变化范围：0-100% 吸光度(absorbance，A)： 透光率的负对数，又称为光密度(Optical density，OD) A= -lgT= lg(I0/It) 吸光度的变化范围： 0 - ∞ 吸光光度法的原理 吸光度的测量 定量分析方法 721E分光光度计的操作方法 721E分光光度计操作练习 分光光度计的误差 Lambert-Beer定律偏离的原因 物质浓度太高，改变了被吸收光的折射率 仪器的局限性 入射光的波长不纯；杂散光的干扰；光电检测器的疲劳现象 非对称的化学平衡 因其浓度、pH、溶剂和温度的改变，发生解离、缔合、溶剂化和互变异构等化学变化而发生偏离。 测量条件的选择 入射光波长 一般选用被测物质溶液的λmax。可以获得较高的灵敏度 控制适当的吸光度测量范围 最小误差出现在T%=20-65% (A=0.2 -0.7)的范围内 选择适当的参比溶液 参比溶液的选择 1、溶剂参比 当被测试液、显色剂及其他试剂在测定波长处都无吸收时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参比溶液。 2、试剂参比 当被测试液无吸收，而显色剂或其他试剂在测定波长处有吸收时，可用不加试样的“试剂空白”作参比溶液。 3、试样参比 若被测试液本身在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收时，可用不加显色剂等的“试样空白”作参比溶液。 吸光光度法的原理 吸光度的测量 定量分析方法 721E分光光度计的操作方法 721E分光光度计操作练习 定量分析方法-1 标准对照法 根据Lambert-Beer定律得： As=abcs Ax=abcx 标准对照法的优缺点 定量分析方法-2 标准曲线法 配制一系列不同的已知浓度的测定物溶液，按测定管同样处理显色，分别读取各管吸光度； 以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 测定时每一个浓度至少应同时做三管（平行管），取其平均值进行标准曲线的绘制。 定量分析方法-3 摩尔吸光系数法 摩尔吸光系数ε是溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm的吸光度。 在已知ε的情况下(查文献)，读取测定液厚度为1cm时的吸光度，即可根据下式求得测定液的浓度。 C=A/ε 摩尔吸光系数法的优缺点 吸光光度法的原理 吸光度的测量 定量分析方法 721E分光光度计的操作方法 721E分光光度计操作练习 721E分光光度计的结构 功能键介绍 1．电源开关 2．“波长调节”旋纽：设置波长。360-760nm. 3．“MODE”键：设置测试方式：T与A 4． “0％T”键： 将比色皿架处于“调零透射比”位置，调T为零。 5．“100%T／0A”键： 使比色皿处于“参比样品”位，用于调整“T为100%”或“A为零”。 6．比色皿架：插放比色皿，有4个槽位。 7．拉杆：推或拉比色皿架拉杆，听到“咔