激光共聚焦显微镜样品制备.pptxVIP

;;2015/10/27; 形态学分析 免疫组织化学 记录基因活动 影响基因活动 原位杂交 多色FISH 细胞追踪;显微镜：明场、相差、微分干涉、荧光图象; ;荧光检测的优缺点;荧光样品染色 免疫荧光细胞化学法 荧光探针 荧光蛋白基因转染 量子点法 ;生物学中应用的荧光探针; 　定位（蛋白质，DNA，脂类） 　互相作用，空间结构改变 　细胞环境报道（pH, Ca++, 酶活性） 　基因表达报道 选择荧光探针 　光谱分离性 　毒性 　光稳定性 　光亮度 ;1.荧光染料;荧光染料;; 一抗选择 一抗特异性高 ;Color outside the lines;MitoTracker;Fluorescence Microscopy Fluorochromes ;2.荧光蛋白;绿色荧光蛋白;荧光蛋白;荧光蛋白主要应用;GFP Targeted Specifically to Subcellular Compartments;转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：;MitoTracker;绿色：示CCL21（淋巴细胞区划因子） 红色a：示Perlecan（基底膜蛋白多糖） 红色b：示Coll IV（IV型胶原） 青色：TRITC-dextr（TRITC-葡聚糖）;荧光细胞化学法：; 30;细胞骨架F-actin（F-肌动蛋白）染色： 　　用FITC或Rhodamine标记的Phalloidin（鬼笔环肽） 　　; 罗丹明123染细胞线粒体（双氢罗丹明123：10uM/ml）： 10ug/ml，室温，15分钟。Ex/Em: 511/534（488/BP505-530） 为膜电荷性染料，对活细胞，能特异与细胞中的线粒体膜结合，产生荧光。 反应线粒体功能。 死细胞无显色。;线粒体探针 Mitotracker;细胞荧光离子探针 （1）游离钙离子含量测定： 有Fura 2 AM, Indo 1和Fluo 3AM, 前两者激发波长为紫外，而且均是双激发波长的比率荧光，所以目前一般在荧光显微镜观察，特别是激光共聚焦显微镜观察中用Fluo 3AM。Ex/Em: 506/526。 Fluo 3本身不发荧光，只有当与胞浆内游离钙离子结合后，受激发光照射才发出荧光。Fluo 3AM不能与游离钙离子结合，但它能穿过细胞膜进入细胞内（Fluo 3 不能透过细胞膜进入细胞），进入细胞后的Fluo 3AM中的AM被细胞内非特异性酯酶水解，变为Fluo 3，Fluo 3与细胞内游离钙离子结合，发出荧光。荧光强弱直接反应了细胞内钙离子 的含量。 Fluo 3AM 染色：Fluo 3AM用DMSO配成贮存液，冰冻保存，使用时终浓度为1uM。染色一般为37℃，30~45分钟。 Fluo 3染色细胞内钙离子，可以通过时间扫描，进行细胞内钙离子含量和分布的动态观察。;Fura-2;Calcium Green-1;（2）细胞内pH的测定： 　　SNAFL：双发射波长比率荧光。Ex: 514(488), Em: 580/640 　　BCECF：双激发波长比率荧光。Ex: 490/440, Em: 530; 笼锁化合物探针 (解笼锁，uncage) 笼锁化合物全称为光不稳定笼锁化合物，是人工使用掩蔽基团修饰生物活性分子而合成的无荧光前体化合物。当该物质被强光照射后，两基团之间的共价键解离而释放出活性分子，这个过程称为解笼锁。;影响荧光组织细胞染色的一些因素 　　荧光染料是否发射荧光或荧光的强弱，主要决定于该染料的分子结构。同时，与它所处的环境及其状态也有密切关系。如染色液的pH值、浓度和染色时的温度以及缓冲液离子浓度等。 1、pH值： 每种荧光素有其最适宜的pH值，改变pH值即可影响荧光素吸收光能的能力和发射荧光的强度。 2、染色溶液的浓度： 一般荧光色素的溶液极淡，增加染液的浓度，荧光亮度也会随之增加，但溶液浓度增加到一定程度时，荧光亮度可达到最大。如果再增加浓度，荧光亮度反而会下降。这是因为由于溶液的浓度过大，色素分子间相互作用形成缔合分子，缔合分子本身起到了荧光淬灭剂的作用。 3、温度： 有些荧光色素在20℃时即开始出现对荧光的淬灭作用。温度越高淬灭作用越强，以至完全淬灭。所以荧光染色必须在适当的温度下进行，才能获得良好的效果。荧光抗体一般在37℃或4℃下进行。FITC影响不大。 4、荧光淬灭物质：