图位克隆原理.ppt

SSLPs SSLPs 40.48% 20.00% 4.76% 4.76% 12.5% 12.5% 36% 步骤总结 筛选 F2 代 短根 移栽 提基因组 各对引物PCR 统计计算Rf 缩小范围 寻找新Marker 扩大群体 (筛选重组子) 3周左右 在突变位点附近区域内绝大部分的样品跑样结果都应该为只有非重组的Col条带，即记录Rf为0，只有少数的样品存在交换，Rf记为1。 图中的6、12号样品即为重组子 什么是重组子 在筛选出6、12号两个重组子以后，假设在目标区域内寻找到新的标记引物，就不需要把所有的个体跑样，只需要跑重组子个体 例： 筛选重组子的目的 Rf Marker1 Marker2 Marker3 6号个体 1 0 1 12号个体 1 0 0 表格的跑样结果显示Marker2最接近突变位点，Marker3次之，下一步可以在Marker2和Marker3附近寻找新标记引物 1. 建议使用一对位于相对确信的区域内的 次低重组率标记引用来筛选 2. 可以根据情况调整用来筛选 重组子的Marker 3. 要选择好用、绝大部分一次 就能扩出来的标记引物 重组子筛选 1.山大丁老师 提供的引物 2.TAIR网上提供的常用Marker 3.AMP上提供的常用Marker 4.TAIR网上公布的所有多态性位点资料 引物寻找 STEP1: 把目标区域内的Marker序列贴进TAIR网上的Seqviewer上搜索目标区域 MPK6 FP: AATCTTGTAATCTGGTGCGTG 点击目标区域 STEP2: 把目标区域内的BAC名字记录下来 例如：K14A17至MRC8之间的BAC名字有 K14A17→MCE21 →MGD8 →MTO12 →MKP6 →MIG5 →MEB5 →MBG14 →MRC8 在拟南芥的众多生态型中最常用的三种是 Landsberg erecta(Ler) Columbia(Col) Wassilewskija(Ws) 其中Col生态型用于拟南芥的全基因组测序。 Marker SSLPs CAPs dCAPs InDel SNP SSLP = simple sequence length polymorphisms 简单序列长度多态性 又称 SSR= simple sequence repeats 比较产物长度 CAPs = cleaved amplified polymorphic sequences 酶切扩增多态性 利用酶切位点 Marker: MIG5-B C L H C dCAPs = derived CAPS 设计引物引入错配碱基，从而引入酶切位点 其它标记 InDel = insertion-deletion 插入缺失标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR 引物，这就是InDel标记。 部分SSLP就是由InDel转化而来 密度： 每 6.6kb 存在一个 SNP = single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。(后面两种情况的多态性一般归为InDel） 密度： 每 3.3kb 存在一个 SSLPs F1 父本染色体 母本染色体 F1 假设： Aa 突变位点 Bb Marker 突变为 隐性突变 F1 配子 长根 长根 长根 长根 长根 短根 短根 长根 长根 短根 F2 短根个体 Col 单带 Ler单带 Col Ler 双带 因为F2代根据表型来筛选个体时，我们人工选择的是短根表型，选择的个体为短根aa，即突变位点不可能存在交换，交换率= 0 其他位点可能存在交换，利用带型差异判断交换次数 wild type mutant 杂交 Col Ler F1 plant 图中的两个亲本不但在A/a位点有差异，在其他位点也存在大量的遗传差异，可以利用这些差异设计分子标记，对染色体的具体区段进行标定。在该例子中，该染色体上总共确定了5个分子标记，标定了5个不同区段。 假设： Aa 突变位点 有5个Marker 只有左侧三种植株会选入定位群体