第十高效液相色谱.pptVIP

该方法的几个突出特点：;经典液相色谱需用20小时才能分离出20种氨基酸，而HPLC只需1小时即可完成。载液在色谱柱内的流速可达1~10mL?min-1。;可达10-11克；所需试样为微升级。;? HPLC方法中，因为在常温下进行分析，因此 固定相的选择比GC多；另一方面可提高色谱 的分离效率。;高效液相色谱仪的结构如下：;主要部件简述：; ;　因为流路中为高压力工作状态，通常使用耐高 压的六通阀进样装置。;5.检测器;紫外检测器的缺点：不适用于紫外光完全不吸收的试样，溶剂的选用也受到一定的限制。;;(2)差示折光检测器：;被平面反射镜9反射出来，成像于棱镜11的棱口上，光束均匀分为两束，到达对称的光电管12上。; 每种物质都有各自不同的折射率，因此都可用差示折光检测器进行检测，所以是一种通用型的浓度检测器。灵敏度为10-7g?mL-1。;根据速率理论，HPLC中影响柱效的因素如下：;2.纵向扩散项 Hd ;固定相传质阻力Hs—主要发生在液液分配色谱 中，类似于气液色谱中的液相传质阻力项。 ;式中Cm是常数(与k有关)，Dm 为组分分子在流动相中的扩散系数。; 可见，减小填料的孔径和粒度，采用低粘度及低流速流动相，适当提高温度等方法都可提高柱效。 由H?dp2可知，其中减小填料粒度是提高柱效的最有效途径；因孔穴深度也同时随之减小。 ;§3-4 HPLC的主要类型及其分离原理;液-液色谱法、液-固色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法、离子色谱法和空间排阻色谱法等。;液-液分配色谱主要有两种类型：;为此将各种有机基团通过化学反应键合上担体表面，代替机械涂渍的液体固定相，如此可克服该方法的缺点。;3.离子交换色谱法 (ion-exchange chromatography); 离子交换色谱法主要用来分离离子或可离解的化合物，20世纪60年代前后，已成功分离了氨基酸、核酸、蛋白质等，在生物化学领域得到了广泛的应用。; 空间排阻色谱法以凝胶(gel)为固定相。分离机理与其它色谱法完全不同。; 试样中的大分子不能进入胶孔而受到排阻，就直接通过柱子首先在色谱图上出现；另外一些小分子可以进入胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，???色谱图上最后出现。; 排阻色谱法中，载液分子通常都很小，它们一般最后被洗脱(tM最大)，结果是：整个试样都在tM (死时间)以前洗脱。;(1)试样峰全部在溶剂的保留时间前出峰，它们 在柱内的停留时间短，故柱内产生的峰扩展 比其他方法小得多。; GC中可供选择的载气只有三四种，它们的性质差异不大。要提高柱的选择性，主要是改变固定相的性质。;(2)避免使用引起柱效损失或保留特性变化的溶 剂。; 常用溶剂的极性顺序排列如下： 水(极性最大)、甲酰胺、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、正丁醇、醋酸乙酯、乙醚、异丙醚、氯仿、苯、甲苯、四氯化碳、二硫化碳、环己烷、煤油(极性最小)。; 正相色谱中，底剂采用低极性溶剂如正己烷、苯、氯仿等；而洗脱剂则根据试样的性质选取极性较强的针对性溶剂如醚、酯、酮、醇和酸等。; 排阻色谱所用的溶剂必须与凝胶本身非常相近，以润湿凝胶并防止吸附作用。对分离大分子化合物，易采用粘度小的溶剂作流动相如四氢呋喃、甲苯等。对分离生物物质，主要采用水、缓冲盐溶液等。; 如果分子量较低，挥发性较高且热稳定的试样，适用于GC法进行测定。HPLC法适用于相对分子质量为200到2000的试样测定，大于2000的宜用空间排阻色谱。; 而异构体的分离，则采用吸附色谱；空间排阻色谱可适用于水或非水溶液，且分子大小要有差别的试样。;;§3-8HPLC应用实例; 上图为血浆中双氢氯噻嗪的分析(反相键 合相色谱) (a)空白血浆 (b)含双氢氯噻嗪病人的血浆(服药后3h)