白细胞抗原系统检测教程文件.pptVIP

CWD原则 HLA等位基因定义为三大类 常见等位基因（Common alleles） 指那些在参考群体中频率大于0.001的等位基因 确认等位基因（Well-documented alleles） 至少在五个独立非亲缘个体中或者三个独立非亲缘个体中并伴有特定的单体型被检测到的等位基因 罕见等位基因（Rare alleles) 除常见等位基因和确认等位基因以外的所有等位基因 它们的频率很低 CWD原则 CWD原则 CWD原则分型中将常见等位基因和确认等位基因合并为CWD,当模棱两可的等位基因组合中出现CWD等位基因可能需要进一步区分，而出现罕见等位基因组合，其临床分型中实际意义有限，可予以排除 单链DNA抽提技术 单链DNA抽提技术将个体两个等位基因进行分离 根据等位基因序列设计生物素标记的特异性探针（仅与某一等位基因互补） 探针与标本基因组DNA进行杂交反应 杂交后将形成单一等位基因DNA/特异性探针复合物 加入链亲和素标记磁珠，将形成单一等位基因DNA/特异性探针/磁珠复合物 洗涤后溶液中只含有单一等位基因DNA/特异性探针/磁珠复合物 单链DNA抽提技术 单链分离技术 探针结合杂交互补 选择性获取单体型 商业产品 HLA-C*01:02 Biotin-CTC CAT gAA gTA TTT CTT CA 图为单链抽提C*01:02后测序的一段序列 第四章 白细胞抗原检测 严力行 目 录 第一节 HLA血清学检测 HLA抗原检测 HLA抗体检测 第二节 HLA细胞学检测 第三节 HLA分子生物学检测 HLA的分子生物学检测方法 HLA常见基因分型方法比较 HLA分型模棱两可结果的原因及其对策 第四节 粒细胞抗原抗体检测 重点提示 HLA抗原检测 掌握微量淋巴细胞毒实验的原理及其影响因素 HLA抗体检测方法 淋巴细胞毒方法 流式细胞仪方法 ELISA方法 Luminex检测技术 掌握不同方法的原理及其优缺点 微量淋巴细胞毒试验 HLA抗原的血清学分型方法 用一系列已知的抗HLA标准分型血清来检测未知淋巴细胞表面的HLA抗原型别 微量淋巴细胞毒实验原理 基于抗原抗体反应 抗原抗体免疫复合物在补体的作用破坏细胞膜 利用染料或其它方法鉴定和区分死活细胞 计分法：NIH计分法 HLA抗血清的来源 HLA抗体血清来源 同种免疫刺激产生HLA同种抗体 HLA抗原免疫刺激动物 杂交瘤技术 人群存在的天然抗体 微量淋巴细胞毒试验的影响因素 HLA抗血清 抗血清来源和抗体种类、抗血清效价、抗血清特性、抗血清质量 淋巴细胞 淋巴细胞活性 、淋巴细胞纯度、淋巴细胞数量、淋巴细胞上抗原表达异常 孵育时间和温度 补体活性 染色和固定时间 血清学抗原分型方法评价 血清学方法抗原分型 检测HLA-Ⅰ类和Ⅱ类抗原 检测HLA-Ⅰ类抗原相对容易 检测HLA-Ⅱ类抗原需要分离和纯化Ｂ淋巴细胞 易受多种因素影响 其错误率相对较高 HLA血清学某一座位上只能检测到一个抗原，而基因分型存在两个不同等位基因，应考虑到无效等位基因 HLA抗体检测 补体依赖的淋巴细胞毒方法（CDC） 采用淋巴细胞作为靶细胞抗原 易受多种因素影响，检测敏感性最低 ELISA 方法 ELISA方法能检测HLA-I和HLA-II抗体 流式细胞术 采用淋巴细胞作为靶细胞抗原 结合荧光检测技术特点 Luminex检测技术 结合荧光流式细胞仪和免疫标记技术 可区分HLA-I和HLA-II抗体 可鉴定抗体的属性和强度 HLA抗体检测 Luminex检测技术 以包被抗原的微球磁珠作为靶细胞 每种磁珠上包被一种抗原 多种磁珠可以在同一体系内反应 待测血清与磁珠孵育 存在HLA抗体时，形成抗原-抗体复合物 加入荧光标记的抗人IgG抗体 形成抗原-抗体-荧光标记抗体复合物 Luminex仪测定微球磁珠上的荧光值 判定HLA抗体的强度和特异性 微球磁珠荧光值大小 每种磁珠的反应特性 第二节 HLA细胞学检测 重点提示 掌握下列方法的基本原理及其应用 混合细胞培养方法（mixed lymphocyte culture，MLC） 纯合分型细胞（homozygote typing cell,HTC） 预致敏淋巴细胞试验（primed lymphocyte test,PLT） 混合淋巴细胞培养 混合淋巴细胞培养（MLC） 二个无关个体的淋巴细胞在体外混合一起培养 二者组织相容性抗原不同，互相刺激对方的T细胞发生增殖 增殖反应强度与组织相容性抗原的差异程度成正比 转化的淋巴母细胞表现为细胞体积增大、核内DNA和RNA合成增加 MLC 用于HLA-D抗原分型 实体器官移植前的快速相容性检测 分为双向MLC和单向MLC 混合淋巴细胞培养 双向MLC 双方的淋巴细胞互相刺激而增生、转化，即双方的