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3、酶 酶细胞化学反应的基本原理是利用酶对其相应底物的水解、氧化等作用,使底物的反应产物被某种捕获剂捕获并在原位沉淀,形成有色的终产物,借此测定该酶在细胞内的分布及活性强弱。 4、核酸 显示DNA的传统方法是Feulgen反应(Feulgen reaction),组织切片或细胞涂片先经稀盐酸处理,使DNA水解,醛基暴露,再用雪夫试剂处理,形成紫红色反应产物。 (四)免疫组织化学术(immunohistochemistry) 利用免疫学抗原和抗体特异性结合的原理,检测组织或细胞中的多肽和蛋白质等大分子物质的分布。为显示抗原抗体复合物的存在,需进行抗体标记;用荧光素如异硫氰酸荧光素标记,可以在荧光显微镜下观察,用胶体金标记,可以在电镜下观察,用辣根过氧化酶标记,则可在光镜下或在电镜下观察。常用的方法有直接法、间接法和亲和素-生物素复合物法(ABC法)等。 荧光的观察(按标本分类) 在荧光显微镜下观察的标本,当然必须发出荧光,可是大多数标本本身不能发出荧光,因而必须用荧光色素处理过才能发出荧光。 (A)自发荧光 (B)二次荧光 (C)抗体荧光技术 (A)自发荧光(不加染色) 有些物质不加染色,也能发出荧光(自发荧光或原发荧光),但在医学和生物学(细胞学、生物组织、培养体等)领域中,只有很少物质具有自发荧光,常采用后两种方法。 测定物质的荧光光谱或者激发光谱,可以判定物质性质(荧光光度法)。 应用:生物学方面——判定维生素,研究生物学上的生物源的胺。 (B)二次荧光(用化学染色) 非荧光性的物质(蛋白质、炭水化合物等)用荧光色素染色,由荧光色素产生荧光(二次荧光),以便进行观察,对特定物体选择合适的荧光色素,该物体就能和周围的组织或细胞区别(分离)出来而可以观察到。 应用:吖啶橙+核酸 金胺+结核菌 介子奎二噁因+染色体 (C)抗体荧光技术(用免疫染色) 利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实,有意识地使带荧光标记的抗体和标本中的抗原进行抗原/抗体反应,这样两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。荧光显微镜最常用于抗体荥光技术进行观察,并成为医学、生物学很多领域中极为有用的工具。 Glial fibrillary acidic protein 荧光色素+物质 激发方法 吸收波长 辐射荧光 (自发荧光) 维生素A 紫外(UV) 325-345nm 470-490nm 维生素B6 紫外(UV) 356 432 儿茶酚胺 紫(V) 410(405-415) 480(475-485) 血清素(5-羟色胺) 紫(V) 390(385-400) 530(520-540) 叶绿素 兰(B) 520 650-660 荧光色素+物质 激发方法 吸收波长 辐射荧光 (二次荧光) 芥子奎二噁因 兰紫(BV) 450 500 四环素+骨,牙 紫(V)或兰(B) 390 560 吖啶橙+DNA 兰(B) 460 530 吖啶橙+RNA 兰(B) 460 650 金胺+结核菌 兰(G) 470 557 福尔根反应+DNA 绿(G) 550 650 溴化乙啶(EB)+DNA 绿(G) 545 605 Propidium Iodide(PI)+DNA 绿(G) 530 615 DAPI+A-T 紫外(U) 372 456 Mithramycin+G-C 兰紫(BV) 395 570 Olivomycin+G-C
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