暗纹东方鲀致病性维氏气单胞菌的分离鉴定.docVIP

PAGE PAGE 1 暗纹东方鲀致病性维氏气单胞菌的分离鉴定 　　摘要：从濒死的暗纹东方鲀（Takifuguobscurus）体内分离到一株优势菌株，经形态观察、生化、16SrDNA聚合酶链式反应（PCR）以及人工感染健康暗纹东方鲀和ICR小鼠等试验可知，该菌对小鼠和暗纹东方鲀半数致死量（LD50）分别为2.26×106CFU/mL、5.96×104CFU/mL；其16SrDNA序列与维氏气单胞菌具有高度的同源性，根据该菌的形态特征、生理生化特性，初步鉴定该菌为维氏气单胞菌（Aeromonasveronii），命名为NT-HV。选择9种水产常用药物进行药敏试验，结果显示该菌对氟苯尼考、复方新诺明、新霉素、氧哌嗪青霉素敏感，对养殖场常用的四环素、强力霉素、羧苄青霉素、氨苄青霉素不敏感，提示在药物的使用过程中应注意药物的浓度和合理轮换。 　　关键词：暗纹东方鲀（Takifuguobscurus）；维氏气单胞菌（Aeromonasveronii）；致病性；分离；鉴定 　　中图分类号：S941.42文献标识码：A文章编号：0439-8114（2013）03-0629-04 　　2010年10月，江苏某特种水产养殖场养殖的暗纹东方鲀（Takifuguobscurus）发生死亡。病鱼主要表现为腹部极度膨大，肛门红肿，体表及胸鳍、腹鳍和臀鳍残缺，鳍条基部充血、出血。解剖发现腹腔内有大量淡黄色带血的腹水流出；肝脏肿大，呈土黄色，有大小不一的出血斑块；胆囊膨大；肠道无食，充满泡沫状黏液，肠黏膜出血。取症状典型的濒死暗纹东方鲀心脏、肝脏病灶进行细菌分离培养，获得一株优势菌株。本研究通过对分离菌进行形态观察、生理生化试验、16SrDNA序列分析，初步鉴定该菌为维氏气单胞菌（Aeromonasveronii），命名为NT-HV，同时对其毒力及药物敏感性进行试验，旨在分析该菌的分类地位、致病因素、筛选敏感药物，为有效防治暗纹东方鲀维氏气单胞菌病提供依据。 　　1材料与方法 　　1.1病料 　　病料取自江苏某特种水产养殖场，濒死暗纹东方鲀体表出血，鳍条缺失、出血，肛门红肿、突出。解剖后发现，腹腔极度积水，肝脏肿大、出血。 　　1.2实验动物 　　清洁级6周龄成年雄性ICR小鼠，体重（25±2）g，由南通大学实验动物中心提供。暗纹东方鲀购自水产市场，每尾重80～100g，试验前在持续流水的水泥池（500L）中驯养2周，证实健康无病后用于试验。试验期间水温控制在25℃左右，投喂暗纹东方鲀专用配合饲料。 　　1.3试剂 　　TaqDNA酶和DNAMarker（DL2000）购自TaKaRa公司；细菌微量生化鉴定管、药敏试纸购于杭州天和微生物试剂有限公司，小量细菌基因组DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司（批号SK8255），其他试剂均为分析纯。 　　1.4病原分离 　　选择具有典型症状、濒死的暗纹东方鲀，无菌操作取其心脏、肝脏，大豆酪蛋白琼脂培养基（Tryptosesoyaagar，TSA）平板划线分离细菌，30℃培养24h，选取优势菌在TSA平板上纯培养，挑取单个菌落进行革兰氏染色，光学显微镜下观察。将分离菌株用斜面保存。 　　1.5生化试验 　　取斜面保藏菌株进行动力试验及微量生化管试验。动力试验用半固体营养琼脂穿刺培养。微量生化管试验按产品使用说明操作。 　　1.6溶血活性检测 　　将分离菌接种至血液琼脂（含7%家兔脱纤血的营养琼脂）培养基，30℃培养24h，观察菌落周围是否出现溶血圈。 　　1.7毒力试验 　　将分离菌接种至胰酪胨大豆肉汤（TSB）培养基，30℃静置培养36h，5000r/min离心10min，收集菌体，0.15mol/LNaCl稀释菌体，用活菌计数法[1]测定菌液浓度，并将菌液稀释为1.8×108、0.9×108、1.8×107、0.9×107、1.8×106、0.9×106、1.8×105、0.9×105CFU/mL共8个浓度梯度，每个浓度接种6只ICR小鼠（腹腔注射，0.2mL/只）和10尾健康暗纹东方鲀（鳍背注射，0.2mL/只），对照组注射等量的无菌生理盐水。连续观察7d并记录小鼠和暗纹东方鲀的死亡时间和数量。按Reed-Muench法计算分离菌的半数致死量（LD50）。 　　1.816SrDNA基因序列测定与系统发育学分析 　　1）PCR模板DNA的制备。将分离菌株接种于TSB培养基，30℃培养16h，小量细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌体DNA作为PCR模板。 　　2）16SrDNA基因序列的PCR扩增与测序。设计16SrDNA基因的2条通用引物：27F（正向引物）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R（反向引物）：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引