昆虫杆状病毒基因工程（第七章）.pptVIP

微生物基因工程 苏州大学生命科学学院 朱 江 、汪成富 2007.8 第七章 昆虫杆状病毒基因工程 7.1 杆状病毒的生物学 7.2 杆状病毒表达载体 7.3 杆状病毒表达系统的优缺点 7.4 杆状病毒表达系统的改进 7.5 杆状病毒表达系统的应用 7.6 杆状病毒表达系统的研究展望 杆状病毒表达系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）是利用携带有外源目的基因的重组杆状病毒作载体，在昆虫体内或其培养细胞内进行表达的一个重组蛋白生产系统 。 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 （Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus， AcMNPV ）表达系统。 家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosisi virus, BmNPV ）表达系统。 前者在殴美国家广泛采用，后者在有家蚕资源的中国、日本应用较多。 7.1 杆状病毒的生物学 杆状病毒科（Baculoviridae） 包含体病毒亚科（Eubaculovirinae） 核型多角体病毒属（Nucleopolyhedrovirus, NPV） 多粒包埋核型多角体病毒亚属（MNPV） 单粒包埋核型多角体病毒亚属（SNPV ） 颗粒体病毒属（Granulovirus, GV） 非包含体病毒亚科（Nudibaculovirinae） 核型多角体病毒两种表型的形态特征及化学组成 7.2 杆状病毒表达载体  A 基本原理 目的基因插入转移载体。 目的基因转移到病毒基因组靶位点，空斑纯化获得重组病毒。 重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫。 杆状病毒表达载体的构建 转移载体 通常由三部分组成： E. coli质粒的复制原点和抗生素抗性基因（如Ampr），保证转移载体能在大肠杆菌中扩增。 含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子，在该启动子下插入要表达的外源基因。 启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒DNA序列，用于与野生病毒DNA同源重组。 直接从昆虫培养细胞和血淋巴中纯化目的蛋白比较困难，为纯化常采用下列方法： (1)在外源基因的前端插入6×His，表达的融合蛋白可通过Ni柱进行亲和层析纯化。 (2)将谷胱甘肽转移酶基因（gst）导入外源基因前端，利用GST能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白。 (3)利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达，该蛋白与生物素具有非常高的结合能力，可以对表达产物进行纯化。 多元转移载体 含有两个或多个相同或不同的启动子可以表达2个 或多个基因。 用双元表达载体表达了抗体的轻链和重链，并能 在昆虫细胞中正确装配成具有生物活性的抗体蛋白。 用四元表达载体表达蓝舌病毒的四个结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7，并在昆虫细胞内正确地装配成类 似病毒粒子的不具感染性的空壳蛋白。 启动外源基因表达的启动子 多角体蛋白（polyhedrin，ph）启动子 ph基因是高效表达的晚期基因，同时对病毒入侵及复制均非必需，而且ph缺失产生无包含体的空斑，在形态上与野生型有多角体的空斑有明显区别，容易被筛选。 P10蛋白启动子 P10基因也是晚期高效表达基因，不是病毒复制所必需。但P10不能产生可识别的表型，导入LacZ等筛选标记，方便筛选。 p6.9基因、p39基因、ie-1基因的启动子也常被用做驱动外源基因的表达，表达水平都不高，但可以用来构建杂合启动子。 Summary of Transfer Plasmid Transfer Plasmid Physical map（2） 重组病毒的筛选方法 野生病毒DNA和重组转移载体DNA共转染，多角体蛋白基因 被外源基因取代，重组病毒形成的空斑无多角体。重组比例0.1～1%。 ①线性化 PaulKitts将Bsu36Ⅰ酶切位点引入多角体基因。新病毒用Bsu36Ⅰ酶切线性化后与转移载体质粒DNA共转染昆虫细胞，共转染子代中获得10～25%的重组病毒。 Kitts和Possee用含有一个Bsu36Ⅰ位点lacZ基因取代了多角体蛋白基因，在多角体蛋白两翼则各有一个Bsu36Ⅰ位点。重组病毒率高达85～99%。 AcMNPV线型化（Kitts et al， 1990） BacPAK6的图谱