内参选择大讨论.pdf

在 western blot 实验中，内参的使用是个很重要的部分， 看到很多站友对内参的选择 经常有些疑问，鉴于此，希望能在一个帖子里面综合所有相关问题，展开讨 论，共同学习。 我先提几个，抛砖引玉，希望大家继续。 1。为什么一定需要内参？内参的重要性。 2 。常用的几种内参。 3 。不同的情况如何选择不同的内参。 支持一下！ 1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如 β- actin 、GAPDH 等等。这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。这 样 western 结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表 明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。严格意义上 说，内参事必须做的。 2 ：常用的内参有： b-actin ，GAPDH，近 2-3 年，更详细的研究发现， β-Tubulin ( 球管蛋白 ) ， 被广泛应 用于 Western Blotting ， β－Tubolin 分子量为 55KD 左右。 3 ：一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差 5KD 以上。因此你要知道你检测的蛋白的分 子量来选择合适的内参！ 个人一些见解，供参考！ 内参的重要性，必要性： 要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是 Western Blot 。 因为 Western Blot 操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变 化。虽然，顺利的时候 Western Blot 做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦 ――做不出结果啦、假阳 性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦 ……毕竟，作为一种有活性的生物大分 子，抗体和抗原的反应毕竟不象 1+1 那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产 物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的 Western Blot 实验设计中要求有良好的参照体系，对实验 结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳 挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量 Marker （用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白 载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可 是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做 Western Blot 往往省略参照，导致结果出现问题时无法 分析结果 ――即便有结果也可能影响结果的分析。 内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用 Western Blot 比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表 达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很 可能影响结果的分析。所以你需要内参。 内参即是内部参照（ Internal Control ），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白 (Housekeeping Proteins) ，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它 来做参照物。在 Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转 膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的 实验误差，保证实验结果的准确性。 在国外发表的文章中， Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少 科研人员在 Western Blotting 实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品 间上样量等同的唯一方法。 然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如 UV 法 直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行 物质的干扰，如