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质粒构建流程 一、引物设计 1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI 2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。 3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1(+)， 4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。 5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。 6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。 7）引物设计完成，送公司合成。 二、目的片段获取 1. RNA提取 试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒 离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20 准备：冰盒、4℃ 操作步骤： 将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。 加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。 4℃ 最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl） 加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀 全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃ 弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s 弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离