动态突变实验原理.pptx

动态突变实验原理市场部文献11996年，TP-PCR被发明的经典文献A.CAG重复数100,P1和P2引物无法扩增；B.扩增早期，P4:P3=1:10，以保证P4被完全消耗；C.扩增晚期，P1和P3引物扩增4kb，即重复超过100的，无法有效扩增；A.重复数正常的健康人；B.重复数50的患者；C.对于重复数超过100的患者，结果可能与正常人一致，只显示一个正常的扩增峰；A.两个等位基因及中间峰都有扩增；11的边界有些错误延伸，以最高峰计算B.两个等位基因及中间峰都有扩增，1个等位基因超出正常值；C.一个等位基因超出扩增范围；文献22011年，双向荧光TP-PCR经典文献常规PCR (PCR-P1/P2)和TP-PCR同时进行；P1-for (FAM labeled) and P2-rev (HEX labeled). TP-PCR was performed with primers P1-for,P4CAG-rev, and P3 in the forward direction, or P2-rev,P4CTG-for, and P3 in the reverse direction.常规PCR 正向TP-PCR反向TP-PCR检测方法动态突变 技术简介TP-PCR(三重引物PCR)人类基因序列中有很多短串联重复序列（STR），由3个或多个碱基组成，不同人之间STR重复数不同，是动态变化的，如果重复数在正常范围之内则不会导致疾病，但如果重复序列发生了扩增使重复数超过了正常范围，即动态突变，则会导致疾病的发生，而且重复数越多发病越严重。P1、P2：正常STR区侧翼引物；P4：STR区特异性引物，后面连有一段通用序列；P3：P4通用序列引物；4种引物按一定比例混合在1管内扩增。检测方法动态突变 实验流程1. 三引物PCR扩增 强直性肌营养不良I型（DM1）是成年人中最常见的遗传性神经肌肉病，为常染色体显性遗传。由DMPK基因3’UTR 区不稳定的（CTG）三核苷酸重复引起该疾病，患者的CTG 重复数从50到几千次，且病情的严重程度与CTG扩增的次数正相关。P1始终作为正向引物，P4与每组CTG随机结合扩增，当P4耗尽后，再以P3作为反向引物以P4的产物为模板进行二次扩增2. 毛细管电泳分析扩增产物 DMPK基因突变类型CTG重复次数（N）临床意义正常5~34低风险前突变35-49突变携带者全突变≥50DM1患者突变链的全长峰正常链的全长峰检测方法动态突变 结果分析突变链的全长峰正常链的全长峰检测结果：CTG重复次数为 12、76 次。计算重复数的方法为：用横坐标标记的全长减去引物碱基个数和重复区域侧翼碱基个数即得到重复区域碱基数，由于重复区域为3碱基重复，所以用重复区域碱基数除以3即得到重复数。DMPK基因突变类型CTG重复次数（N）临床意义正常5~34低风险前突变35-49突变携带者全突变≥50DM1患者ALS C9orf72