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(三) 电泳: 1.概念: 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.原理: ①许多重要的生物大分子,如多肽、 核酸等都具有可解离的基团,在一定的PH下,这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小,形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。 3.类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 琼脂糖凝胶电泳示意图 聚丙稀酰胺凝胶电泳 1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠(SDS)—聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 (SDS的作用)为了消除净电荷对迁移率的影响, 可以在凝胶中加入SDS。 2.原理: 聚丙稀酰胺凝胶电泳 SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链,因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别,使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 3. SDS作用机理: 用SDS测定蛋白质分子量的方法 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时,可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳,根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置,用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线,可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。 二、实验操作 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 1.样品处理: (一)蛋白质提取和分离步骤 (二)操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。 (1)红细胞的洗涤: ①洗涤目的: 去除杂蛋白,以利于后续血红蛋白的 分离纯化,洗涤次数不可过少。 ②洗涤操作: 1、采集血样。2、低速短时间离心(速度越高和时间越长,会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀,达不到分离的效果)3、吸取血浆:上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤:用五倍体积的质量分数为0.9%的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心(低速短时间)6、重复4、5步骤三次,直至上清液中已没有黄色,表明洗涤干净。 (2)血红蛋白的释放: 加蒸馏水到原血液体积,再加40%体积的甲苯 ,置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂),细胞破裂释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液: ①过程:将搅拌好混合液转移到离心管内,以2000r/min的速度离心10 min。②试管中溶液层次:第1层(最上层):甲苯层(无色透明);第2层(中上层):脂溶性物质沉淀层(白色薄层固体);第3层(中下层):血红蛋白的水溶液层(红色透明液体);第4层(最下层):杂质沉淀层(暗红色)。③分离:用滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。 二、实验操作 甲苯层(无色透明) 白色薄层固体 红色透明液体 杂质沉淀层(暗红色) 试管中溶液层次 (4)透析: ①过程:取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中(pH为7.0),透析12小时。②透析目的:除去样品中分子量较小的杂质。 二、实验操作 2.凝胶色谱操作: (1)凝胶色谱柱的制作: ①取长40厘米,内径1.6厘米的玻璃管,两端需用砂纸磨平。②底塞的制作:打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网,再用100目尼龙纱包好,插到玻璃管的一端。注意事项:底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面,否则难以铺实尼龙网,还会导致液体残留,蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作:打孔→安装玻璃管。④组装:将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。 (2)凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择:A、材料:交联葡聚糖凝胶(G-75)。B、代表意义:“G”表示凝胶的交联程度,膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值,即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理:配置凝胶悬浮液:计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后,配成凝胶悬浮液。 ③凝胶色
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