电镜技术和超薄切片技术(研究生).pptVIP

谢谢！ 知识回顾Knowledge Review * * 阿贝公式 以下以氧化还原酶（可分为氧化酶和脱氢酶两种）为例进行说明。 在氧化酶细胞化学反应中含有两个既分开又紧密联系的底物，一个是生理底物如氧或过氧化氢；另一个是捕捉底物，通常是四盐酸3，3‘二氨基联苯胺（DAB）。DAB很容易氧化，经过一系列化学变化生成强嗜锇性的聚合物，再经锇酸固定就形成锇黑。 脱氢酶常用的捕捉剂为铁氰化物，它在酶的作用下被还原为亚铁氰化物，在铜离子的存在下进一步形成高度不溶性的亚铁氰化铜沉淀。 酶细胞化学的常规操作流程 1、固定：常规固定液选取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作为固定 液，常用的缓冲液有二甲砷酸钠缓冲液及Tris缓冲液等。 2、切片：一般采用组织切片机进行切片，厚度在40～60μm，也可以 用冰冻切片机切片。 3、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟。 4、孵育：孵育时必须在使用前配置新鲜孵育液。将切片放入孵育液内， 在震荡式恒温水浴箱中孵育，孵育温度一般为37℃。 5、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟，然后用 0.1M二甲砷酸钠缓冲液漂洗3次，每次10分钟，所用缓冲液 要保持在4℃左右。 6、后固定：用0.1M二甲砷酸钠缓冲液配置的1%锇酸固定1小时。 脱水、浸透、包埋、切片同常规超薄切片制作。 7、电镜观察：超薄切片经烘干后直接进行电镜观察。如果反差不好， 可以进行铅—铀双重染色，但必须有不染色的切片对照。 免疫电镜胶体金标记技术 免疫电镜胶体金标记技术也称金标法（或免疫金染色）。金标法是利用胶体金（Colloidal gold）在碱性环境中带负电荷的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记。电镜下金颗粒密度很高，清晰可辨。 胶体金是金的水溶胶，主要用还原法制备。较多用的还原剂有枸橼酸钠、白磷、鞣酸、乙醇、抗坏血酸、过氧化氢等。 枸橼酸三钠还原法 1）取0.01%氯化金（HAuCl4或AuCl3HCl溶液）100ml，放入洁净锥形瓶内煮沸。 2）取1%枸橼酸三钠水溶液4ml，加入煮沸的氯化金中。 3）混合、搅拌、煮沸，约5分钟，溶液颜色由蓝→紫→橙红，冷却后即可。 此时胶体金颗粒直径约为15nm。如将枸橼酸三钠的量分别减少至1.5ml、1.0ml、0.75ml,则胶体金颗粒直径将分别增至30、50或60nm. 胶体金标记物（金探针）的制备 1、胶体金标记蛋白质及其纯化 1）取100ml胶体金PH为7.2。 2）称取相应最适量蛋白质，于去离子水中溶解（100ul）。 3）在磁力搅拌器中将上述两液混合、静置。 4）10分钟后再加入胶体金稳定剂，如3%聚乙二醇（PEG）或5% 小牛血清白蛋白（BSA）。 5）用超速离心法去除未标记蛋白质。离心速度和时间取决于金颗 粒大小及蛋白质的种类。胶体金标记羊抗兔IgG，以牛血清白蛋 白稳定者，先用低速离心20分钟（金颗粒20nm者用250转/分，5 nm者用4000转/分，视金颗粒实际大小情况而定离心速度）。留 取上清液，再以高速离心，4℃下离心1小时（金颗粒20nm者用 14000转/分，5 nm者用60000转/分，视金颗粒实际大小情况而定 离心速度）。弃上清液，留取沉淀物备用。 6）将沉淀物用0.02M PBS(pH8.2,内含1%BSA或PEG)悬浮、清 净，高速离心，重复三次，最后将胶体金标记物溶于原液体积 1/10的TBS中，即可应用。 免疫金染色法，可分为包埋前染色和包埋后染色。包埋前染色对细胞膜的穿透性差，一般只用于细胞表面抗原的标记。因此，现今普遍采用包埋后染色。 电镜包埋后胶体金染色法 1）超薄切片80 nm左右置于无支持膜的镍网上。 2）至1～10%H2O2液中处理10分钟～1小时不等，越硬需要H2O2 浓度越高越利于抗体进入。 3）双蒸馏水洗3次，每次5～10分钟。 4）浮于正常羊血清（1：50～1：100）液滴上， 室温30～60分钟， 或1：5，5分钟。 5）PBS漂洗3分钟，PBS（内含1%牛血清白蛋白）PH8.2中，5分钟。 6）加适量稀释的胶体金标记抗体液（1：30～1：100），淡红色为 适宜稀释液，4℃20小时或室温10分钟～2小时。 7）双蒸馏水洗3次，每次3分钟。 8）