《分子生物学讲座》-公开课件.ppt

二、平末端连接 T4 DNA连接酶能催化DNA平末端的连接。如果目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供利用，用不同的限制性内切酶切割后的粘性末端不能互补结合，则可用适当的酶将DNA突出的末端削平或补齐成平末端，再用T4 DNA连接酶连接，但平末端连接要比粘性末端连接的效率低得多。 第五节 目的基因导入细胞 目的基因序列与载体连接后，要导入细胞中才能繁殖扩增，再经过筛选，才能获得重组DNA分子克隆，不同的载体在不同的宿主细胞中繁殖，导入细胞的方法也不相同。 一、原核细胞 1、热激和电激 由于外源DNA的进入而使细胞遗传特性改变称为转化。1943年Avery等就发现肺炎双球菌转化现象。 DNA自然进入细胞的效率很低，在基因工程中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。例如大肠杆菌经冰冷CaCl2的处理，就成为感受态细菌，当加入重组质粒并突然由4℃转入42℃作短时间处理，质粒DNA就能进入细菌；用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔转化法。 2、感染 噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖就是感染（infection）。用经人工改造的噬菌体活病毒作载体，以其DNA与目的序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖。 3、转染 重组的噬菌体DNA也可象质粒DNA的方式进入宿主菌，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成感受态细菌再接受DNA，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。 农杆菌转化法 基因枪法 其他方法 二、真核细胞 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 发根农杆菌(A. rhizogenes) 1、农杆菌转化 根癌农杆菌浸染 发根农杆菌浸染 * * 第二节 基因工程载体 一、作为载体的条件： 分离的基因自身不能繁殖，需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。对理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求。 ①能在宿主细胞中复制，而且最好要有较高的复制能力。 ②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。 ③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体上要有合适的酶切位点。 ④容易从宿主细胞中分离纯化出来。 ⑤有容易被识别筛选的标志。 二、载体的种类 按照性质分： 质粒载体 病毒载体 按照功能分： 克隆载体 表达载体 穿梭载体 常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。 一、质粒载体 质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下： ①是染色体外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed circuar DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300 kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制，是能独立复制的复制子。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类： 严紧控制（stringent control）型：复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞只有一个到十几个拷贝； 松弛控制（relaxed control）型：复制和宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。 ③质粒对宿主生存并不是必需的。 这点不同于线粒体，线粒体DNA也是环状双链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的一部分，质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，也不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖 。 二、噬菌体载体 1、结构 噬菌体（phage）是感染细菌的一类病毒，有的噬菌体基因组较大，例入λ噬菌和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。 λ噬菌体由头和尾构成，DNA装在头部蛋白质外壳的里面。其基因组长48502bp，为线性双链DNA。 λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖 。 ①溶菌性方式（lytic pathway）：在营养充足，条件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料