ANXA11通过Cdc42他分子及Erk信号通路调控人肝癌Bel7402细胞恶性行为-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docx

目 目 录 一、摘要 一1 (一)中文摘要 1 (二)英文摘要 3 二、正文 一6 前言日【J舌 一一6 第一部分ANXAl l表达稳定下调的Bel7402单克隆细胞株的建立 (一)材料和方法 7 (二)结果 ．13 (三)讨论 ．．14 (四)结论 ．．15 第二部分ANXAl l对Bel7402细胞恶性表型及耐药性的影响 (一)材料和方法 ． ．．16 (二)结果 ．22 (三)讨论 27 (四)结论 27 第三部分ANXAl l调控Bel7402细胞生物学行为的分子机制研究 (一)材料和方法 ．29 (二)结果 ．33 (三)讨论 ．．38 (四)结论 ．39 (五)参考文献 ．．40 万方数据 三、综述 三、综述 ．．43 (一)综述 ．．43 (二)参考文献 ．47 四、致谢 49 万方数据 大连医科大学硕士学位论文ANxAll通过Cdc42分子及Erk信号通路调控人肝癌 大连医科大学硕士学位论文 ANxAll通过Cdc42分子及Erk信号通路调控人肝癌 Bel7402细胞恶性行为 硕士生名字：董盼盼 指导教师：孙明忠教授 指导小组：刘淑清教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘要 背景：膜联蛋白A1l(Anncxin A11，ANXAll)是膜联蛋白家族成员，其异常表 达与卵巢癌恶变、乳腺癌和结直肠癌耐药、转移及预后相关，本组前期研究表明 ANXAl l异常表达与鼠肝癌Hca．P细胞迁移、侵袭、耐药及淋巴道转移相关，本 论文进一步研究ANXAll水平变化对人肝癌Bel7402细胞恶性行为、药物敏感 性及其调控的分子机制。 目的：1、将pGPU6／GFP／Neo．shRNA．ANXA 1 1表达载体稳转至Bel7402，筛选 ANXAl 1稳定下调的单克隆细胞株；2、探究ANXAl 1下调对Bel7402增殖、克 隆形成、迁移、侵袭、细胞形态、黏附、细胞骨架及耐药性的影响；3、探究ANXAll 调控Bel7402恶性行为的分子机制。 方法：l、采用脂质体转染法将pGPU6／GFP／Neo．shANXAl 1表达载体转染至 Bel7402，经G418筛选获得ANXAll稳定下调的单克隆细胞株，qRT-PCR和 Western Blot方法检测ANXAl 1在细胞中水平变化；2、MTT法分析ANXAl 1 下调对细胞增殖能力影响；3、平板克隆形成实验考察ANXAl 1下调对细胞克隆 形成能力影响；4、结晶紫染色法观察ANXAl 1下调对细胞形态影响；5、Transwell 小室法分析ANXAl 1下调对细胞迁移侵袭能力影响；6、FITC．Phalloidin标记丝 状肌动蛋白F．actin比较ANXAl 1下调对细胞骨架影响；7、细胞黏附及淋巴结 黏附实验分别分析ANXAl 1下调对细胞与细胞外基质黏附、细胞对淋巴结粘附 能力影响；8、MTT结合Hoechst33258凋亡染色分析ANXAl 1下调对细胞耐药 性及抗药物诱导凋亡影响；9、qRT-PCR、Western Blot联合蛋白质组学方法寻找 ANXAl 1调控Bel7402恶性行为相关联分子；10、在ANXAl 1稳定下调细胞株 中瞬时转染siRNA．Cdc42，观察细胞转移能力恢复、定Cdc42在ANXAl 1调控 万方数据 大连医科大学硕士学位论文Bel7402细胞转移能力中的作用。 大连医科大学硕士学位论文 Bel7402细胞转移能力中的作用。 结果：1、获得ANXAll稳定下调的单克隆细胞株Bel7402一shANXAll一l和 Bel7402．shANXAll-2，在mRNA水平分别降低73．O％(P=0．0016)、63．8％ (JP=0．0029)，蛋白水平分别降低90．0％(P=0．0001)、88．O％(P=0．0003)；2、 较Bel7402．shCtrl，Bel7402．shANXA 1 1-1和Bel7402．shANXA 1 1-2增殖能力明显 减弱；3、较Bel7402一shCtrl，Bel7402．shANXAll一1和Bel7402-shANXAll-2克 隆形成能力降低57．4％和75．0％(尸O．0001)；4、Bel7402．shANXAll-1和Bel7402． shANXAll-2较Bel7402．shCtrl迁移能力均上升2．3倍(P=0．0034、P=0．0015)， 侵袭能力分别上升3．4(尸=0．0012)、3．3倍(P=-0．0066)；5、与Bel7402．shCtrl相 比，Bel7402．shANXAl 1-1和Bel7402．shANXAl 1．2细胞变细长，丝状伪足明显 增加，应力纤维蛋白表达量增加，外周致密带毛糙不规则；6、较Bel7402．shCtrl， Bel