AREGEGFR信号轴介导胰腺癌EMT效应及相关机制的研究与人胰红腺星形细胞永生化建系.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 中国医学科学院中国协和医科大学博士学位论文中文摘要 中国医学科学院中国协和医科大学博士学位论文 中文摘要 背景和目的 由于大部分胰腺癌患者被确诊时疾病已经发展至进展期，因而丧失了通过手术 完全切除肿瘤的机会。加之胰腺癌对于放疗、化疗治疗的敏感性有限。使得寻找有 关胰腺癌诊断、治疗及判断患者预后的新标志物意义重大。胰腺星形细胞(PSC)与 胰腺癌细胞的相互作用是胰腺癌发病机制研究的热点，这两种细胞间的相互作用能 更真实地模拟胰腺癌复杂的微环境。 本文内容包括两个部分： 第一部分对AREG／EGFR在胰腺癌中的表达及其作用进行探讨。 (1)对EGFR、EGFRvlII和AREG在胰腺癌组织中的表达情况及其与病人的临床 病理特征和预后的相关性进行研究； (2)对AREG／EGFR信号轴介导胰腺癌EMT效应及相关机制进行研究。 第二部分对人胰腺星形细胞进行永生化建系处理，为后期继续研究AREG在PSC 中所起的作用提供实验材料基础。 方祛 第一部分(1)首先，采用免疫组织化学染色对92例胰腺导管腺癌组织进行 EGFR、EGFRvlII和AREG表达检测，通过卡方检验判断EGFR、EGFRvlII、AREG及 AREG／EGFR共表达情况与胰腺癌临床特征的关系，利用Pearson检验对AREG表达和 EGFR表达之间进行相关性分析；制作Kaplan—Meier生存曲线，通过log—rank检验 比较高表达／低表达组间的生存差异，最后利用COX回归进行多因素分析。 (2)利用RNA干扰技术和重组蛋白研究AREG对胰腺癌细胞系自身侵袭和迁移 能力的影响。采用细胞划痕实验，细胞迁移实验和细胞侵袭实验验证细胞运动能力， 使用删P／TIMP蛋白质芯片筛选AREG对胰腺癌删P／TIMP蛋白质表达的影响，利用 Western blot验证AREG／EGFR对胰腺癌细胞系EMT蛋白及转录因子的表达的影响， 使用EGFR、MEKl／2和NF-K B抑制剂验证AREG／EGFR活化下游信号通路改变情况。 同时，验证AREG在4例原代培养PSC中的表达情况，研究PSC对胰腺癌细胞侵袭 和迁移能力的影响。 第二部分建立人胰腺星形细胞永生化细胞系。使用重组慢病毒将SV40LT抗原 基因和hTERT基因导入原代hPSC，经过嘌呤霉素抗性筛选及扩大培养。通过光学显 微镜、免疫组化、染色体核型分析、生长曲线测定、裸鼠成瘤实验等研究其生物学 特性。 万方数据 中国医学科学院中国协和医科大学博士学位论文结果 中国医学科学院中国协和医科大学博士学位论文 结果 第一部分(1)在胰腺癌组织中，EGFR阳性表达率为46．7％(43／92)，EGFRvlII阳 性表达率为13％(12／92)，AREG阳性表达率为53．3％(49／92)。EGFR和EGFRvIII阳性 表达部位为细胞膜及细胞浆，AREG阳性表达部位为细胞浆；EGFR表达与肿瘤的分 化程度相关，AREG／EGFR共表达与肿瘤的分化程度相关；AREG表达和EGFR表达之 间无相关性(西=o．039，P：O．709)；单因素生存分析结果显示，AREG表达(P=O．021， P=O．003)、TNM分期(P=O．003，P=O．001)和肿瘤分化程度(P=O．009，P=O．002)是胰腺 癌患者DFS和0s预后不良的有关因素。多因素分析结果显示肿瘤分化程度(DFS HR=I．785，P：O．021；OS HR=2．125，P：O．004)是胰腺癌患者预后DFS和0s预后不 良的独立影响因素。此外，AREG表达(HR：I．822，P=O．03)、TNM分期(HR：2．25，P：O．03) 和手术切缘状态(HR=I．84，P=O．045)是胰腺癌患者0S预后不良的独立影响因素。 (2)细胞划痕实验，细胞迁移能力实验和细胞体外侵袭实验结果显示：敲低 AsPC一1细胞AREG表达能显著下调肿瘤细胞的迁移、侵袭能力。Western blot及IF 结果显示，敲低AREG表达使AsPC-I细胞EMT相关蛋白表达水平发生改变，包括 E-cadherin和z0一l表达水平上升，Vimentin及13-catenin的表达水平下降，EMT 相关转录因子Snail、Slug和ZEBl的表达水平水平下调；删P／TIMP蛋白芯片结果 显示，AREG对胰腺癌多种脚P／TIMP蛋白质表达有影响，其中对iMP一9影响最显著。 同时，AREG受体EGFR的磷酸化水平显著下调；敲低AREG表达能拮抗AREG／EGFR信 号轴对ERK、AKT和STAT3等多条信号通路活化作用。转录因子NF—K B入核水平显 著下降。上调AREG表达能够增强PANC-1细胞的迁移、侵袭能力。外源性升高AREG 表达使PANC-1