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TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测ERCC1变异剪接体检测平台的建立 前言 对一个基因的各个变异剪接体分别进行精确定检测是深入研究变异剪接的基础。在TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术( TaqMan real-time quantity RT-PCR)出现前，传统的检测方法有4种[1, 2]：（1）Northern blot; (2)核酶保护分析；（3）相对定量RT-PCR，（4）竞争定量RT-PCR这些方法都有其内在的局限性。Northern blot耗时，随时面临RNA降解的困扰，而且灵敏度不高，需要相对大量的RNA才能检测出来，仅仅适合相对定量分析[3]。核酶保护分析比Northern blot相对灵敏，但是仍然耗时而且需要相对大量的RNA才方便检测[4-8]。相对定量RT-PCR则需要在每个反应的指数扩增期停止反应后进行凝胶电泳分析，由于每个样本的起始拷贝数不一致，很难确保每个样本均处于相同的指数扩增期。而且此方法需要将PCR产物进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，增加了步骤，而且增加了污染的可能性[9]。竞争定量RT-PCR则需要根据不同的目的基因片断构建相应的竞争子，然后需要确定每个反应体系中竞争子和目的基因的不同比例，不仅仅耗时而且繁琐，更重要的是竞争子的构建不仅仅需要很大的技巧性，而是是一件极其艰难的工作[10, 11]。这些传统技术不仅繁琐耗时，而且对mRNA的质量要求较高，结果不稳定。而且，这些传统的方法由于方法学上的差异性，导致研究结果不十分可靠，各研究机构之间的结果差异较大。 应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术则可以分别精确检测各个变异剪接体的表达量，结果稳定，可重复性高，方便快捷，程序简单，无需后续处理，几无污染[1, 12-14]。本研究拟建立对切除修复交叉互补基因1即ERCC1（excision repair cross-complementation group 1）变异剪接体的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测平台，为深入研究ERCC1的变异剪接奠定基础[15]。 TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术的基本原理是通过设计与目的序列互补的一段寡核苷酸作为TaqMan探针，在此探针的5’端标记报告基团（如FAM），在3’端标记淬灭基团（如TAMRA）。当探针完整时，报告基团所发射的荧光通过荧光共振能量传递（FRET）被淬灭基团所吸收，从而不能检测到其荧光。Taq酶则具有5’外切酶活性，在PCR的延伸阶段，可以从探针的5’端将报告基团水解掉，并将整个探针完全水解，使得报告基团和淬灭基团的原有空间结构被打散，荧光共振能量传递不复存在，从而可以探测到反应体系中报告基团所发射的荧光。随着PCR循环的增加，荧光也不断的累加，从而反映产物的生成情况[16-18] 变异剪接（alternative splicing）是真核生物中广泛存在的一个现象[22-27]，可以调节基因的表达水平[28]，增加蛋白质的多样性[29, 30]，并对肿瘤的生物学行为有很大的影响[22, 27, 31-34]，和肺癌[13]、乳腺癌[35-37]、卵巢癌等的发生发展存在一定的关系。 ERCC1是核酸切除修复系统NER（nucleotide excision repair）的一个关键基因，在以铂类为基础的化疗中扮演着重要角色。铂类药物通过与细胞DNA形成加合物（Pt-DNA adducts）从而杀伤肿瘤细胞，NER则可以通过切除加合物并修复被损伤的DNA，从而降低化疗的效果。研究表明ERCC1的mRNA表达量与 肿瘤患者的化疗敏感性和生存时间具有一定的相关性[38]。 ERCC1基因共10个外显子，细胞中存在不同比例的两种形式的剪接体，为含10个外显子的全长剪接体mRNA (full length, FL),和缺失第VIII外显子（长72bp），仅含9个外显子的变异剪接体mRNA( alternative splicing, AS)[39-41]。 1 ERCC1基因结构特征分析（文章写作不规范，[ERCC1基因结构特征分析]一节是属于材料方法，还是前言部分？我认为这部分ERCC1在GenBank的背景，可以放在综述里） 根据GenBank数据库提供的信息，ERCC1基因ID为GeneID: 2067，位于19号染色体长臂，处于19q13.2-q13.3位置。 ERCC1在染色体的位置：chromosome: 19; Location: 19q13.2-q13.3 Official Symbol ERCC1 and Name: excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 1