第四章HPLC--公开课件.pptVIP

一、吸附色谱的分离机理 吸附色谱概述 分离基于样品的极性差异。 洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱 常用的流动相∶ 非极性有机溶剂，如己烷 乙酸等为添加剂 常用固定相∶ 硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。 二、分配色谱的分离机理 分配色谱概述 反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱 常用的流动相： 有机溶剂如甲醇、乙腈，水 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基团 反相色谱固定相多为键合相? 键合相色谱柱 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 优点∶ 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点∶ pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同 离子交换树脂的分离机理 离子交换色谱概述 适用于离子型化合物的分离 分离基于离子的带电特性 洗脱次序受多种因素的影响 填料（离子交换树脂）的种类∶阴/阳，强/弱，交换基团 样品分子特性 盐的种类、浓度 温度及pH值 有机溶剂 离子交换树脂的交换容量 体积排除色谱的分离机理 凝胶色谱概述 凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC） 分离基于分子在溶液中的体积大小 洗脱次序：大分子先被洗脱 流动相不参与分离，只起溶剂作用 分离效率低 色谱行为容易预测 液相色谱柱及分离机理的关系 从色谱方法上分 正相 / 反相 离子交换 分子体积排除 亲合 疏水回受 从柱子类型上分 分配 / 吸附 离子交换 凝胶 亲合 色谱柱化学及外形结构的关系 七 色谱分离方法的选择 要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。 选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。 一、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在200 ~ 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000，则可用空间排阻色谱法。 七 色谱分离方法的选择 二、溶解度 弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），（油溶性样品或相对非极性的混合物），则可采用液一固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。 七 色谱分离方法的选择 三、化学结构 用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。 若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。现列出表作为选择分离类型的参考。 极性问题 2. 对HPLC柱的了解 平均颗粒度，颗粒度分布 颗粒度(dp) 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差) 颗粒分布 颗粒分布越宽∶柱效低(渗透性差) 颗粒形状 球型∶柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展 对HPLC柱的了解（二） 平均孔径/孔体积 孔径/孔体积分布 大的孔径可分析高分子量的分子 对HPLC柱的了解（三） 键合相化学 影响化合物的分离度：a 不同键合相对不同种类的化合物分离不同 可能导致色谱的分离机理不同 如：C18、C8、CN 对HPLC柱的了解（四） 含碳量 含碳量越高，k‘值越大（固定相传质效应增加） 高含碳量 有利于不易保留的化合物的分离 水解稳定性好，重现性好 有利于极性化合物的拖尾改善 低含碳量 有利于分析中性及碱性化合物 降低溶剂损耗 不同色谱柱的含碳量 色谱柱 C% k‘苊 (50/50的乙腈/水) Symmetry C18 19 17 Zorbax ODS 17 15.7 LiChrosorb RP-18 15 10.3 Symmetry C8