免疫细胞化学技术.docVIP

免疫细胞化学技术 免疫细胞化学，与免疫组织化学（Immunohistochemistry）相同，它 是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。 免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 抗原和抗体的要求 · 具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。 – 对抗体的要求：纯度高、比活性强； · 高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。 – 对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。 抗原 (antigen, Ag) · 抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性： – 免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性； – 免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。 · 根据抗原是否显示免疫原性分为： – 完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。 · 免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。 – 半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。 · 半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。 载 体 · 通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。 – 常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。 – 用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。 （三）抗体 (antibody, Ab) 1、抗体的概念： 免疫球蛋白 · 机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。 – 抗体主要存在于血清内； – 抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。 – 免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。 2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。 · 单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。 – 特异性强、抗体产量高。 · 多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 – 特异性低，会产生抗体的交叉反应。 – 多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。 – 抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。 3、抗体的制备——多克隆抗体的制备 · 动物的选择 · 佐剂(adjuvant) · 免疫方法 · 免疫剂量 · 抗体效价的测定 · 放血或定期抽血 (1) 动物的选择 选择什么动物来免疫取决于： · 所需抗血清的量 – 小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。 · 能供免疫用的抗原量 – 小鼠50?g足够，而山羊需要几毫克。 (1) 动物的选择(续) · 动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。 – 例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。 – 常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。 (2) 佐剂 (adjuvant) · 一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。 · 最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为: – 弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant) – 弗氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant) 弗氏不完全佐剂 (Freunds incomplete adjuvant, FIA) · 是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。 · 使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。 弗氏完全佐剂 (Freunds complete adjuvant, FCA) · 在弗