基因工程周岩基因工程载体.pptVIP

第四章 基因工程载体 作为一个理想的载体，应具备以下条件： 第一节 微生物基因工程载体 一、质粒载体 2、转移型和非转移型质粒 3. 质粒的不相容性和不亲和群 （二）质粒的命名 1. 人工组建的质粒 （三）常用质粒载体 1. pSC101 2. pBR322 （1）组成 （2）特点 （3）重组克隆的 “插入失活”筛选方法 3、pUC系列质粒载体 （1）特点 可用组化方法鉴别： 可通过插入失活法进行筛选 二、噬菌体载体 （一）λ噬菌体载体 2、λ噬菌体的缺陷与改造 λ噬菌体的改造 3. λ噬菌体的主要类型 （1）插入型载体 （二）M13 噬菌体载体 三、噬菌粒载体（科斯质粒，cosmid ） 四、酵母菌载体 整合型：含有酵母的筛选标记 ura3，但不具有酵母的复制起始点该质粒 DNA 以单拷贝形式稳定遗传，缺点是转化率较低（1～10 转化子/μg DNA）. 第二节 植物基因工程载体 一、根癌农杆菌及Ti质粒 （二）Ti质粒及 T-DNA 的结构与功能 1. T-DNA 区 （三）农杆菌对寄主的侵染和 T-DNA 的转移 （四）Ti质粒作为植物基因工程的载体 （五）Ti质粒的改造 1、去除致瘤基因Onc 二、Ri 质粒载体 三、CaMV(花椰菜花叶病毒)载体系统 1、互补载体系统 2、混合载体系统 四、脂质体(liposomes)载体 （一）、脂质体结构与性质 （二）脂质体与细胞的相互作用 第三节 动物基因工程载体 一、SV40 1、SV40 基因组 二、其它病毒载体 附加型：是在 pBR322 中插入酵母筛选标记和2uDNA 的 ARS 序列构建成的。这种质粒以附加体的形式存在于真核细胞中。附加型型载体对酵母具有很高的转化活性（102～103 转化子/μg DNA），且与复制型相比，稳定性高，拷贝数也较高（25～100分子/ 细胞）。 稳定型：在附加型载体中再插入酵母着丝粒的一个 DNA片段（CEN）。 （一）根癌农杆菌与冠瘿瘤 根癌农杆菌属根瘤菌科农杆菌属，通过伤口可感染双子叶植物，并在创伤部位使组织恶性增生而形成植物肿瘤，叫冠瘿瘤（crown gall tumor）。 冠瘿碱 类植物激素 章鱼碱 胭脂碱 农杆碱 Ti质粒是农杆菌非染色体的环状双链 DNA 分子，分子量为 90×106～150×106 道尔顿，有160~240 kb。 致病菌株 37℃培养 治愈菌株 （Ti 质粒被消除） 治愈菌株 与致病菌株接合 致病菌株（重新获得Ti质粒） 胭脂碱型质粒 T 区大小约 23 kb，单一序列插入植物核 DNA。 章鱼碱型 左区(TL-DNA)：长约 13 kb，通常为单拷贝，有诱发和维持肿瘤的作用。 右区(TR-DNA)：长约 7kb，多拷贝含有参与冠瘿碱生物合成的蛋白酶的编码基因。 图 章鱼碱pTiAch5和胭脂碱pTiC58质粒的遗传图 共同区：T 区有控制肿瘤形态和编码冠瘿碱合成酶基因，实际上shi基因与生长素合成有关。roi 基因与细胞分裂素合成有关，Ocs 是章鱼碱合成酶基因，Agr 是编码农杆碱合成酶基因，章鱼碱型与胭脂碱型的 T 区中上述基因分布不完全一致，但 90％是相同的称共同区。 3 个同源区段，含有 6 个基因位点，是冠瘿瘤形成所必需的，统称“致癌基因” (oncogene，onc)。 非同源序列则编码冠瘿碱合成酶，在胭脂碱型中叫 Nos，章鱼碱型酶叫 Ocs。 共同区 已知 T-DNA 的两侧是被一对保守的 25 bp 的重复序列包围着，而且在一系列不同的植物肿瘤DNA 中发现，T-DNA 的两边端点是位于这种同向重复序列的当中或附近，这种同向重复序列实际上就是T-DNA 的边缘区。 右侧边缘区又叫 RB 序列，左侧边缘区又叫LB 序列。 2、毒性Vir 区 VirA、B、D和G为致瘤性，它们的突变型为非致病性。 VirA、C、D 编码专一核酸内切酶蛋白，与 VirB 共同作用，与 T-DNA 迁移直接有关。 VirC 部分决定寄主范围 VirE 与菌体感染过程有关 Vir 区大约 35 kb，包含 6 个互补群，A、B、C、 D、E、G。 3、代谢区 Tra，T-DNA 转移功能； Agr，农杆碱代谢； Inc，不同类型质粒代谢相容性； Occ 和 Noc，章鱼碱和胭脂碱分解代谢。 1、侵染过程 2、T-DNA 的转移 （1）创伤植物细胞释放出可激活Ti质粒 Vir 基因进行转录的蛋白因子； （2）VirA 和 VirD 蛋白因子进一步激活其它的 Vir 基因进行表达； （3）先在Ti质粒右侧边缘区产生出头一个单链缺口； （4）接着在 Ti 质粒左侧边缘区产生出另一个单链缺口，结果释放出的单链 T-DN