第3章--细胞生物学研究方法(翟中和第四版)讲课资料.pptVIP

第3章 细胞生物学研究方法;本章主要内容; 显微镜观察范围 肉眼观察范围;肉眼 0.2 mm 光学显微镜 0.2 μm 电子显微镜 0.2 nm 扫描隧道显微镜 样品制备技术;一、光学显微镜 (light microscope);（一）普通复式光学显微镜——组成;（一）普通复式光学显微镜——成像;（一）普通复式光学显微镜——分辨率;;（一）普通复式光学显微镜——样品制备;（二）相差显微镜和微分干涉显微镜;（二）相差显微镜和微分干涉显微镜;（二）相差显微镜和微分干涉显微镜;Four types of light microscopy;正置显微镜与倒置显微镜比较;（三）荧光显微镜——基本原理;（三）荧光显微镜——基本原理;1.照明方式通常为落射式 2.光源为紫外光或其他短波 长的光 3.有两个特殊的滤光片 (发射滤片和阻断滤片);荧光显微镜光路系统;（三）荧光显微镜——样品制备;（三）荧光显微镜——应用;（四）激光扫描共焦显微镜;（四）激光扫描共焦显微镜;3D Image Reconstruction;;荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜（b）;二、电子显微镜;（一）透射电子显微镜 ;1．电子显微镜与光学显微镜的基本区别; 光镜 电镜 光源 可见光（300-700nm）电子束 紫外光（200nm） 分辨率 200nm 0.2nm 透镜 玻璃透镜 磁透镜 真空 无要求 1.33*10-3—10-5Pa ;2．电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数;3．电子显微镜的基本构造;（二）透射电镜制样技术——超薄切片技术;超薄切片技术显示的细胞超微结构;（二）透射电镜制样技术——负染色技术;（二）透射电镜制样技术——冷冻蚀刻技术;冰冻蚀刻电镜照片 ;透射电镜照片与冰冻断裂 和冰冻蚀刻电镜照片比较;电镜三维重构与低温电镜技术;（三）扫描电镜技术;（三）扫描电镜技术;小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较;三、扫描隧道显微镜;第二节 细胞及其组分的分析方法;一、用超离心技术分离细胞组分;一、用超离心技术分离细胞组分;二、细胞成分的细胞化学显示方法;福尔根反应 Feulgen stain;三、特异蛋白抗原的定位与定性;（一）免疫荧光技术;（二）免疫电镜技术;四、细胞内特异核酸的定位与定性;原位杂交技术;FISH (Fluorescent In Situ Hybridization);五、定量细胞化学分析与细胞分选技术; 流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。（flow cytometer）。;/resources/education/tutorials/4Intro_Flow/player.html;应用 1.分析细胞中DNA, RNA 含量和细胞表面分子含量 2. 细胞、细胞组分的分选;第三节 细胞培养与细胞工程;一、细胞培养——动物细胞培养;动物细胞培养;目前实验室中常用的几种细胞系 ;一、细胞培养——植物细胞培养;一、细胞培养——植物细胞培养;二、细胞工程;（一）细胞融合与单克隆抗体技术;单克隆抗体与多克隆抗体;单克隆抗体的制备;（二）显微操作技术与动物的克隆;克隆羊多莉的培育;第四节 细胞及生物大分子的动态变化;一、荧光漂白恢复技术;fluorescence photobleaching recovery， FPR;二、单分子技术与细胞生命活动的研究;use optical traps to probe the stepping of single molecules of kinesin;三、酵母双杂交技术;四、荧光共振能量转移技术(FRET);FRET产生的条件;FRET 的基本原理;检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用 如果两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出的荧光可激发另一蛋白产生荧光;五、放射自显影技术;根据实验要求选择合适的同位素;对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪：持续标记、脉冲标记 显微放射自显影 电镜放射自显影;胰岛B细胞电镜放射自显