分子克隆课件.pptVIP

分子克隆; （一）基本概念: 克隆（Clone) 指的是通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。 分子克隆（Molecular Cloning) 是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。 ;;分子克隆的基本过程;目的基因的获取-----PCR技术:;Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…; 此酶具有以下特点： ①耐高温， ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩??反应后再加新酶。 ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。 在?1989?年，Science?将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子?(Molecule?of?the?year) ;①94℃变性;; ①模板：单链或双链DNA ②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 ④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂 ;4.PCR反应程序 ⑴94~96℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） ⑵94℃ 30’’ 变性 ⑶50-60℃ 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） ⑷72℃ n’(按1’扩增1kb计算）延伸 ⑹72℃ 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） ⑺4-10℃ 保存; 3.与反转录相关的PCR扩增;ＲＴ－ＰＣＲ;PCR结果图; 重组DNA导入宿主细胞的类型;重组DNA的筛选与鉴定;2.分子克隆中常用工具酶： （1）. 使核酸降解的核酸酶类： 核酸内切酶、核酸外切酶。 （2）.催化核酸合成的酶类： DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。 ; 是由细菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌体内，这种内切酶可以分解外源性的DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护。;限制性内切酶(Restriction Endonuclease);TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)中，能以DNA为模板，从结合在模板上的引物出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从5’-3’方向合成新的DNA链。TaqDNA聚合酶在70～75℃时具有最佳的生物活性，随着温度的降低，酶活性明显下降。同时此酶缺乏3’-5’外切酶活性，因而无校正功能。 ;催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键形成的酶，称为DNA连接酶(DNA ligase)。DNA连接酶主要有两种： T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶 ; 3.基因克隆常用载体 目前用于基因克隆的载体种类繁多，包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌体载体、酵母菌质粒载体以及动、植物病毒载体等 ;⑵.质粒载体：;氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因： 此基因编码?内酰胺酶，该酶能水解氨苄青霉素?—内酰胺环，使之失效而使细菌产生耐药。 ;;4.目的基因的分离与制备 ⑴、人工合成基因 ⑵、应用聚合酶链反应获取目的基因;5.目的基因的体外重组 DNA分子的体外重组:是DNA分子之间的连接过程。这是一个DNA连接酶催化的生物化学反应 。;6.重组子导入宿主细胞 体外重组生成的重组子必须导入到合适的宿主细胞中才能进行复制、扩增和表达。 宿主细胞分为两种：原核细胞和真核细胞。 ;⑴感受态细胞(competent cell): 系指利用理化的方法人工诱导细菌，使之处于易于吸收和容纳外源DNA分子的状态，这时的细胞就称为感受态细胞。 ;⑵转化过程： ①.用冰预冷的CaCl2处理细胞：即用低渗CaCl2溶液在0℃时处理快速生长的细胞，从而获得感受态细胞。 ②.此时细胞膨胀成球型，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。;（二）DNA进入细胞： ③.通过热激作用促进细胞对DNA的