甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用.pptVIP

甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 阿丽娅，宋有鑫，姜保国 北京大学人民医院创伤骨科 背景介绍 中枢神经系统损伤危害 传统脊髓损伤的治疗策略 组织工程再生医学概念 支架材料 + 种子细胞（生长因子……） 支架材料的研究趋势 天然支架材料 人工合成不可降解支架材料 人工合成生物可降解支架材料 生物学特性 对生物体无毒性和炎症反应 易于在体内降解吸收 降解吸收周期适宜，可人为调控 前期实验已证实 “甲壳质套管能够促进损伤 后的周围神经再生 ” 种子细胞 骨髓间充质干细胞 神经干细胞 雪旺氏细胞 嗅鞘细胞 目的：初步探讨对脊髓损伤修复是否有影响 　　甲壳质套管 + 骨髓间充质干细胞 一、 材料和方法 ---材料准备 甲壳质套管：无菌 3-4mm 骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSCs)体外培养 品系：雄性小鼠C57BL，表达绿色荧光蛋白 体重：20g±2 取材：股骨、胫骨、髂骨 换液培养，取传代后第3代细胞移植（异种移植） 实验动物 70只雄性SD大鼠，体重约300±25g 动物模型为脊髓右侧半横断伤，随机分4组,每组20只（除正常组） 正常组：10只 对照组：单纯半切损伤模型，不予任何治疗； 甲壳质套管治疗组：半切损伤后套管植入治疗； 甲壳质套管联合 MSCs组: 半切损伤后套管植入,移植细胞； 取材时间点: 2w,4w,8w,14w,长期组（ ②③组） 1d,5d,7d,4w,8w（④组） 脊髓半切损伤动物模型制作流程 ---方法和评估指标 1 套管内脊髓损伤位点组织学观察 1.1 脊髓空洞（免疫组化---HE染色） 8w时组织固定、脱水、浸蜡、包埋、切片，HE染色 1.2 胶质瘢痕（免疫荧光---检测星形胶质细胞，GFAP染色） 2w/8w组织固定-再后固定，包埋，冰冻切片，丙酮固 定后洗片封闭，分别加入抗大鼠GFAP蛋白一抗和相应二抗 1.3 轴突（透射电镜--- 2W和14W时检测超微结构） 戊二醛固定，后固定，脱水包埋，切片，复染后观察 2. 检测神经纤维是否穿越损伤位点 2.1 神经逆行性示踪：对照组、套管组分别在2周、14周于损伤位点远端注 射10%BDA, 多点注射，10天后取大脑和脊髓，脊髓分为近段、远段和损伤段，染色显影，阳性细胞计数 2.2 功能学评价：BBB功能评分；知觉功能评分，分别在术后1w，2w，4w，6w， 8w，10w，12w, 14w检测 3. 检测MSCs在套管内的生长情况： 激光共聚焦显微镜观察是否增殖、迁移，分别在1d，5d，7d，4w，8w检测 二、实验结果 1 脊髓损伤位点组织学观察 1.1 脊髓空洞（8W） 1.2 胶质瘢痕（2W） 1.3 脊髓内部超微结构---轴突 2 检测神经纤维穿越损伤位点 阳性细胞计数 2.2 功能学评价---BBB评分 ---知觉功能评分 3 检测MSCs在套管内的生长情况 3.2 MSCs在脊髓中增殖 三、小结与讨论 小 结 从组织学、功能学角度评价脊髓半横断损伤后再生状况 （1）长期观察发现本实验用到的甲壳质套管在脊髓中有固形作用 （2）应用甲壳质套管或复合MSCs，脊髓空洞、胶质瘢痕均相对减少，髓鞘再生状态良好；但套管组和套管联合干细胞组之间比较差异不明显 （3）应用甲壳质套管或复合MSCs，发现大鼠运动功能和知觉功能均得到明显的改善，功能恢复均显著优于单纯脊髓半切，逆行示踪结果也表明神经再生过程中，部分神经纤维跨过损伤位点生长；但套管组和套管联合干细胞组之间比较差异不明显。 MSCs移植脊髓损伤位点后，发现： （1）MSCs在脊髓中能够从损伤位点远端向近端迁移，从脊髓边缘向中央迁移 （2）8周时干细胞大量增殖 讨 论 本实验首次将改造后的甲壳质套管用于修复大鼠脊髓半切损伤 脊髓组织中甲壳质套管能固形、支持，有良好的生物相容性 体内甲壳