第七章克隆基因的表达2007植物基因工程.pptVIP

根癌农杆菌侵染的诱导信号及作用机理 （1）酚类化合物 酚类物质——农杆菌浸染植物细胞所必需的诱导物，同时将其作为趋化物来识别。 实验证明，一些植物中常见的酚类化合物的混合物都可激活Vir区基因。如：儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、β-羟基苯甲酸、原儿茶酸、香草醛。 Stachel等在烟草叶片的伤口诱出液中确认了两种主要的Vir区基因诱导物：乙酰丁香酮AS和羟基乙酰丁香酮OH-AS。AS效果最好，0.5~1.0μmol/L即可诱导Vir活化。 （2）中性糖和酸性糖 中性糖在Vir基因诱导和致病毒力中也起重要作用。Shimoda等人，在限定AS诱导条件下，发现许多中性糖（L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔罗糖、2-脱氧-D-葡萄糖）都可增强一些Vir区基因的诱导。这些中性糖是通过chvE和VirA起作用，chvE编码葡萄糖和半乳糖结合蛋白，识别伤口产生的糖单体，导致农杆菌的趋化作用。 酸性多糖是组成植物细胞壁中果胶质的主要成分。最近的实验证明，酸性糖（胡萝卜根提取物中蒸馏出来）可改变农杆菌基因的表达。蛋白质标记实验表明，至少有10种蛋白质合成被其诱导，一种被阻遏。 （3）pH值 5.0~5.5的低pH值。诱导物对pH的要求是.6.0, 在农杆菌培养在含有酚类化合物（AS）的培养基中时，pH5.0 ~5.8 Vir的诱导达到一个最高水平 3. Ti质粒载体 （1）能够自发地整合到植物的染色体上。 （2）能转化多种植物。 （3）强启动子 T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。 3. 1 Ti质粒作为载体的可能性 （1）分子量太大（200kb）！ （2）限制性酶切位点太多。 （3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能 再分化。 （4）在大肠杆菌中不能复制。 3.2. 天然Ti质粒作载体的缺点 转入萤火虫的luciferase的烟草 烟草叶片表达B型肝炎抗原 提高外源基因在植物细胞中的表达效率的策略 1、构建高效表达的转化载体 选择合适的启动子（如组织特异性启动子、强启动子等） 组入完整的基因表达调控序列---转录（）和翻译（） 合理插入内含子---提高外源基因的表达 2、防止外源基因失活 在某些情况下外源基因表现为基因沉默。造成沉默的原因较多，它可能与基因的重复拷贝、DNA的甲基化、染色质结构重拍和转录产物的不稳定等有关。在实际工作中，分离单拷贝的转基因个体；通过构建含有核基质支架附着区的转化载体，改进外源基因的稳定性 C 高等植物基因工程的进展 1983 年 美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜 1994 年 世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市 1995 年 转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入生产 2000 年 美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆 国际上获得转基因植株的植物已达100种以上，包括水稻、玉米、马铃薯、小麦等作物；棉花、大豆、油菜、甘草、猕猴桃、亚麻、甜菜、向日葵等经济作物；番茄、黄瓜、芥菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生菜、芦笋、芹菜等蔬菜作物；苜蓿、白三叶草等牧草；苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓、梨等瓜果；矮牵牛、菊花、香石竹、伽蓝菜等花卉；杨树等造林树种 ?基因枪的出现，使大豆转基因成为现实，实际上目前大豆已成为许多难转化作物的模式作物。抗除草剂 Bastar和Roundup的基因也已转入大豆，建立了可实用的大豆转化体系。 ?由于水稻未成熟胚再生植株的能力很强，几乎所有水稻栽培品种均能由未成熟幼胚再生。最近水稻幼胚和盾片来源的愈伤组织，用根癌农杆菌转化都获得了转基因植株。 ?抗烟草花叶病毒的番茄植株，抗病毒烟草相继获得成功。 ?在天蚕、家蚕、柞蚕蛹的血淋巴中发现，经诱导后可产生15种蛋白，可分为天蚕素、 Attacin及溶菌酶等三类不同的杀菌肽，对革兰氏阳性和阴性菌有广谱的抗菌活性。 Jaynes实验室（1991）将天蚕素 B及两种人工合成的杀菌肽基因转入烟草，经青枯菌接种，发现转基因烟草发病延迟，病情指数及死亡率降低。 1 2N6愈伤诱导 2 N6-BA预培养 3 N6-H选择培养 优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程 4 植株再生 农杆菌介导法转基因的基本流程及优化策略 生理状态 来源（盾片） 植物愈伤组织的诱导 农杆菌的活化 愈伤组织 农杆菌 的共培养 抗性愈伤组织 获得及植株再生 菌 种 活化状态 培养基成分 缩短组培时间 提高再生频率 生活习性 土壤习居菌，主要生活在曾被多种植物生活过的土壤中 好氧，但也能在低氧压的植物组织中生长 最适温25~30℃ pH4.0~12.0，最适pH6.0~9.0 不形成芽孢 根癌农