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第二节 细胞培养方法及应用实例 一、动物细胞培养方法 二、植物细胞培养方法 三、细胞培养反应器 四、动物细胞工程应用实例 * 一、动物细胞培养方法 二、植物细胞培养方法 三、细胞培养反应器 四、细胞工程应用实例 Cell development method and it’s applied solid example 根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培养及固定化培养等三种方法。 1.贴壁培养 所谓贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面（如：培养皿、培养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性 贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。 ⑵主要优点 细胞紧密黏附于固相表面，易更换培养液；易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统；适用于所有类型细胞。 ⑶主要缺点 与悬浮培养法相比：扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长。 ⑷细胞贴壁的表面 要求具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷密度；若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。 2.悬浮培养 悬浮培养是对非依赖性细胞培养的一种方法。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。 悬浮培养投资较小，扩大培养规模简单（只须增大培养体积）。如：淋巴细胞的培养可采用悬浮培养法。 细胞悬浮培养瓶 进入分裂的静止期。 对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。 在悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将 3.固定化培养 所谓固定化培养是指，将动物细胞与不溶性载体结合起来进行培养的方法。简单地，说就是将被培养生物体固定在一定的培养基上进行培养的过程。 动物细胞的固定化易于细胞与产物的分离及产品的纯化。因此，固定化是实现动物细胞高密度长期培养、从而提高生物反应器生产效率的重要技术途径。 常见的固定化方法有：吸附法、共价贴附法、交联法和包埋法等。 ⑴吸附法 所谓吸附法是指：用固体吸附剂将动物细胞吸附在其表面，从而使细胞固定化。 吸附法的主要优点是：操作简便、条件温和；其主要缺点是：载体的负荷能力低，细胞易脱落。 ⑵共价贴附法 所谓共价贴附法是指：利用共价键将动物细胞与固体载体结合的细胞固定化方法。 共价贴附法连接键非常牢固，能有效地减少细胞泄漏；因化学试剂的引入，对细胞的活性有一定的影响。 ⑶交联法 使用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团如氨基、羧基等进行交联，形成共价键来固定细胞，其结合力是共价键。此法制备的细胞与载体结合紧密，但制备麻烦，活力损失较大。 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微胶囊型两种。 ⑷包埋法 常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养等方法。 1.愈伤组织培养 所谓愈伤组织培养是指，将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。 植物组织 (消毒) MS培养基 愈伤组织 切取 接种 培养 什么是愈伤组织？ 长出茎、叶 生根培养 试管苗 资料卡片 愈伤组织（callus） 在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。 愈伤组织在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。 在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期。即：启动期（细胞准备进行分裂期）、分裂期和形成期。 2.原生质体培养 取植株的幼胚、根、茎或叶等组织细胞，用纤维素酶或果胶酶除去植物体细胞的细胞壁（原生质体），在培养基上生长分裂，通过愈伤组织诱导分化长出茎、叶，再长出根形成植株。 植物细胞 愈伤组织 长出茎、叶 生根培养 驯化移栽 原生质体 分离