工业微生物育种20140809——娄忻老师(1).pptVIP

32 2014.8.9~8.10成都 抗药性突变株的筛选 ------梯度平板法 ? ? ? 纯种选育应挑选主型菌落 诱变育种则各种类型的正常菌落都应挑选 保留的菌落中要有一定的主型菌落 群体中的主型代表了其表型特征，一个菌种的产量 水平亦是其主型菌落产量水平的体现。 菌种选育------平板预筛 菌落挑选原则 2014.8.9~8.10成都 33 出现不同菌落类型的原因 ? ? 主要原因：遗传因素 自发突变 回复突变 异核体 杂交 次要原因：非遗传因素 培养条件、培养基 平板不匀 生长阶段 34 2014.8.9~8.10成都 ? ? 35 2014.8.9~8.10成都 初筛 以量为主，精确性其次。 通常一个菌株接一个摇瓶，以目的物产量（活性）为选择指标。 复筛 以质为主，精确测定菌株的生产指标。 1. 考察菌种生产能力的自然波动范围 2. 复筛的菌种作斜面传代，以考察稳定性 3. 复筛多次后的菌种用于留种保藏 通常一个菌株接三个以上的摇瓶，重复三批以上，以提高重现性。 摇瓶试验条件要接近生产工艺条件 菌种选育 ------摇瓶筛选 摇瓶筛选通常分为初筛、复试两步进行: 菌种选育------摇瓶筛选 36 2014.8.9~8.10成都 ? ? ? ? 摇瓶筛选实际上是各变异株之间的对比试验，摇瓶条 件（培养基、装量、封口介质、转速、温湿度等）要 力求一致。 除产量指标外，摇瓶筛选还可考察： 母瓶生长速度、稠度 发酵瓶外观颜色、稠度（菌浓）、pH等 注意对照菌株（出发菌株）的设臵 还可将生产菌株加为对照 摇瓶筛选是一种重复性和计量性的工作，需要对筛选 过程中摇瓶产量数据的分布做全面分析，以帮助判断 诱变及筛选条件的选择是否恰当。 ? ? 37 2014.8.9~8.10成都 菌种选育------摇瓶筛选 摇瓶筛选工艺的调整 培养基 尽量使用工业原材料与生产罐基本一致，这样可以淘 汰不适应生产条件的菌株。 培养条件 按照预设目的，可改变摇瓶培养的温度、通气量、培 养周期等条件，以获得所需菌株。 对于用做菌种选育的出发菌株，特别是单位较低的菌 株，首先应进行培养基及培养条件的筛选。同样对于 获得的高产菌株也应进行培养基及培养条件的优化。 ? ? 通过碳源、氮源、无机盐单因素实验或正交设计、均匀 设计、响应面实验等方法，确定菌种的最适配方 思路 38 2014.8.9~8.10成都 菌种选育------培养基优化 培养基优化应与菌种选育工作交叉进行，并 在 菌种选育过程中及时应用新的培养基。 原有成份量上的加、减 成份的替代 成份的简化 菌种选育过程中培养基的优化对菌种生产能力的提升至关重要 菌种选育------菌种特性考察 ? ? ? 遗传基因型纯度的考察 菌落类型越少越好；主要菌落形态（菌型）的百分比越高 越好，应占群体的90%以上。 传代稳定性 以各代间生产能力的差异程度来反映菌种的遗传稳定性。 其它 菌体量、糖、氮利用、蒸发量、需氧量等 39 2014.8.9~8.10成都 传代稳定性试验方法 当传至 F5代时与同时培养好的前 4代斜面同批进行摇瓶发酵，检测发酵单位等指标 2014.8.9~8.10成都 40 考察不同装量或不同转速下摇瓶的发酵 单位，确定该菌种对氧的需求程度 考察 不同温度下的发酵单位， 确定 该菌种最适发酵温度 考察不同比例的接种量，确 定该菌种发酵最适接种量 考察不同种龄下的菌丝状态及菌体 量，确定较适种龄 摇瓶发酵实验 摇瓶培养基装量或 摇床转速实验 发酵摇瓶温度实验 发酵摇瓶接种量实验 种龄实验 2014.8.9~8.10成都 41 42 2014.8.9~8.10成都 菌种选育------理性化筛选方案 初级代谢产物高产菌株的筛选 1. 降低终产物浓度 （ 1 ）筛选终产物营养缺陷型 （ 2 ）筛选细胞膜透性改变的突变株 2. 筛选抗反馈调节突变株 （ 1 ）筛选结构类似物抗性突变株 （ 2 ）利用回复突变筛选抗反馈突变株 43 2014.8.9~8.10成都 菌种选育------理性化筛选方案 次级代谢产物高产菌株的筛选 1. 筛选营养缺陷型突变