第十章重组DNA的构建筛选及鉴定分析.pptVIP

第十章 重组DNA的构建、筛选及鉴定分析 1. 重组DNA导入宿主细胞 2. 重组子的筛选 3. 阳性重组子的验证与分析 mRNA差别显示技术 在寻找新基因工作中起到积极的作用 发育机理研究 杂种优势机理研究 二 重组DNA的构建 2 粘性末端分子的连接 相同的粘性末端，在进行连接时，这两个 DNA 片段在 DNA 连接酶作用下就可以共价地连接起来，形成重组 DNA 基因枪法，又称微弹轰击法是利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进人细胞内的现象，将包裹在金属颗粒表面的外源 DNA 分子随之带人细胞进行表达的基因转化方法。 宿主细胞 转化的目的 一是大量产生重组 DNA 在完成连接反应后，重组 DNA 往往只有纳克级的量，不易操作和进一步分析 二是对重组 DNA 进行纯化。在构建重组 DNA 过程中很难保证体系中不污染其他的 DNA 分子 第二节 重组子的筛选 一、遗传表型筛选法遗传表型筛选法 利用抗药性基因的筛选方法 b一半乳糖昔酶显色互补筛 利用抗药性基因的筛选方法 抗性标记直接筛选法 载体 DNA 上携带有宿主细胞敏感的抗生素的抗性基因， pBR322 质粒载体，它上面含有的氨卞青霉素抗性基因和四环素抗性基因 抗性基因插入失活筛选法 当用某种限制性核酸内切酶消化并在此位点插入外源目的 DNA 时，抗药性基因不再被表达，称为基因插入失活。因此，当此插人外源 DNA 的重组质粒载体转化宿主菌并在药物选择平板上培养时，根据对该药物由抗性转变为敏感这一特征，观察菌落生长状况便可筛选出阳性重组子 利用抗药性基因的筛选方法 b一半乳糖苷酶显色互补筛选 蓝-白筛选 β-半乳糖苷酶可被安慰诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）诱导的启动子调控之下 β-半乳糖苷酶能把培养基中无色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝 营养缺陷互补 营养缺陷型是指某菌株经突变后，丧失了合成某营养素(氨基酸，维生素，核酸等)的功能，若在培养基上培养必须添加相应的营养素才能生长 如果外源基因能够实现其功能的表达,重组 DNA 转化到大肠杆菌宿主细胞之后，则它所表现出来的表型性状即可作为重组子筛选的标记 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时，将该基因重组后转人缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中，在仅仅缺少亮氨酸的基本培养基上筛选，只有能利用表达产物亮氨酸的细菌才能生长，因此，获得的转化子都是重组子 二、快速裂解菌落鉴定重组DNA分子 DNA 分子由于外源目的基因片段插人到质粒载体上，所以重组质粒的相对分子量一定比非重组质粒要大 固相液相杂交，亦称膜上印迹杂交 提取重物重组质粒 DNA 琼脂糖凝胶电泳分离 碱变性液浸饱 中和液漂洗 进行 DNA 印迹转移 80 ℃ 下烘烤 1 h 或 短波紫外线交联法固定 DNA 与放射性同位素标记探针杂交 放射自显影后～确定阳性重组子 DNA 探针 检测灵敏度高； 标记方法简单； 相对稳定，保存时间长； 特异的理化性质如光 探针的来源 一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针； 另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNA探针。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。 在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。 探针的制备 一般是通过分子克隆（molecular cloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠肝菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。  cDNA 探针，首先需分离纯化相应mRNA，在逆转录酶的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)，cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但内含子已在加工过程中切除 寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成 核酸探针标记 为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记。标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等 四