酶的结构纯化及活性十一.pptVIP

一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种选择性称为酶的特异性或专一性。 一、 结构特异性 1. 键特异性 对底物分子中其所作用的键要求严格，而不管键两端所连基团的性质 2. 基团特异性 要求底物具有特定的化学键，而且对键的一端所连基团也有一定要求 3. 绝对特异性 酶对作用的底物要求相当严格，甚至只能催化一种底物进行化学反应 绝对特异性 　　酶只作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物 。 　　如： 相对特异性 　　酶作用于一类化合物或一种化学键（键特异性）。 六、酶原和酶原的激活 六、同工酶（isoenzyme） 选材：材料中酶含量要高且易于处理，然后对材料破碎，离心并收集目标酶。 粗制分离：用盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂分级分离法等对目标酶进行粗分离 精制分离：用柱层析法、梯度离心等对粗酶进一步纯化 酶制剂的脱盐、浓缩、干燥和保存 用透析法、超滤法、凝胶过滤法来脱盐； 用沉淀法、吸收法、超滤法等除去水分，称浓缩； 用冷冻真空干燥法对酶做处理，便于运输；酶需低温保存 1）酶活力单位的标准化规定 在最佳条件或某一固定条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需要的酶量为一个酶活力单位。 2、基本操作程序 3、酶分离纯化时的注意事项 纯化时保持低温，温度越低越好 使用温和的操作条件 使用一些保护试剂，如金属螯合剂等 尽量缩短纯化时间 二、酶活力的测定 酶活力：又称为酶活性，通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示。 基本原理: 最优化条件下，当底物足够，酶促反应的初速度与酶的浓度成正比，化学反应速度可代表酶活性分子浓度。 1、酶活力测定 酶活力测定就是测定一定量的酶，在单位时间内产物(P)的生成量或底物（S）的消耗量。 即测定时确定三种量：①加入一定量的酶；②一定时间间隔；③物质的增减量。 酶活测定时一般测定产物的增加量 在反应过程中产物是从无到有，变化量明显，极利于测定，所以大都测定产物的生成量。 具体物质量的测定，常用的方法有： 光谱分析法：酶将产物转变为（直接或间接）一个可用分光光度法或荧光光度法测出的化合物。 化学法：利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测出的化合物，然后再反过来算出酶的活性。 放射性化学法：用同位素标记的底物，经酶作用后生成含放射性的产物，在一定时间内，生成的放射性产物量与酶活性成正比。 测酶活所用的反应条件应该是最适条件，所谓最适条件包括最适温度、最适pH、足够大的底物浓度、适宜的离子强度、适当稀释的酶液及严格的反应时间，抑制剂不可有，辅助因子不可缺。 3、酶反应条件优化 4. 酶活力的表示方法及计算 2）如果底物（S）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示1分钟使1μmol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2μmol底物转化的酶量称为一个酶单位。 3）酶的比活力 酶的比活力是每单位（一般是mg）蛋白质中的酶活力单位数（如：酶单位/mg蛋白）。 对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少），所以比活力是评价酶纯度高低的一个指标。 第五节 酶工程 酶工程 是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，是将酶学原理、化学工程技术及基因重组技术有机结合在一起而形成的新型应用技术。 根据研究内容不同，酶工程分为两类： 化学酶工程 生物酶工程 化学酶工程 化学酶工程主要涉及酶的制备、酶的化学修饰、酶的固定化等。 (1) 自然酶 是指由生物材料中分离出来的酶。 (2) 化学修饰酶 又称“生物分子工程” ，是通过对酶分子实行“手术”以达到改构和改性的目的。 (3) 固定化酶 将酶分子通过吸附、交联、包埋及共价键结合束缚于某种特定支持物上而发挥酶的作用。可反复使用 。 (4) 人工合成酶 模拟酶的催化功能，用化学方法合成具有专一性的催化剂。 酶的化学修饰： 用人工方法将酶分子与一些小分子化学基团或具有生物相容性的大分子进行共价修饰，从而改变酶的性质，创造出天然酶没有的优良性能。 将酶吸附在载体表面（载体结合法 ） 将酶相互连接起来（交联法) 将酶包埋在细微网格里(包埋法） 酶的固定化： 通过吸附、共价结合、包埋及交联等方式束缚于某种支持物上发挥酶的作用。 1）载体结合法 载体结合法是指将酶固定到非水溶性载体上的方法。物理吸附法、离子结合法、共价结合法。 2）交联法：通过双功能试剂，将酶和酶联结成网