酵母核糖核酸的分离及组分鉴定1.pptVIP

酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 目的与要求 1. 了解稀碱法提取RNA的原理、方法 2. 掌握核酸中三大组分的鉴定方法 原 理 核糖核酸RNA：从细胞核和细胞质中分离出来的化学物质。 在蛋白质合成和其他生化反应中起着重要作用，RNA的结构和DNA的结构类似，都是由核苷酸按照一定顺序排列成的长链。 RNA可以分为信使RNA、转运RNA、核糖体RNA以及其他类型的RNA。 酵母菌单细胞真菌 酵母中主要成分是RNA（2.67～10.0%)，DNA很少 (0.03～0.516%)。 总RNA的提取: 采用稀碱裂解法，乙醇沉淀RNA, 洗涤除杂质； RNA组分鉴定:硫酸可使RNA水解，再分别鉴定 1. 核糖的鉴定——苔黑酚(3,5—二羟基甲苯)法 2. 碱基的鉴定——嘌呤碱 嘌呤碱+过量浓氨水+AgNO3 絮状嘌呤银化合物 3. 磷酸的测定——定磷法 (NH4)2MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4)2SO4 H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10)4+12H2O+12H2O H3P(Mo3O10)4 Mo2O3MoO3(钼蓝） 试剂和器材 试 剂： 0.04M NaOH；酸性乙醇溶液, 95%乙醇 1.5M硫酸； 浓氨水，0.1M硝酸银； 三氯化铁浓盐溶液 , 苔黑酚乙醇； 定磷试剂 器 材 研钵，天平； 沸水浴， 低速台式离心机。 3.将沉淀用95%乙醇洗两次，约3毫升/管，用于除去表面杂质。 第一次将沉淀捣散后再3000转离心3min；第二次将沉淀捣散过滤，旨在将沉淀誊出来，放在滤纸上凉干，称量。（差减法称量，滤纸应提前称好） 4.将所有提取物转移到小三角瓶/大试管中，加适量1.5M硫酸进行水解，再分别鉴定组份。 离心注意事项： 1.样品倒入玻璃离心管不能太满； 2.离心前玻璃离心管（套上塑料管套）放在天平上平衡好； 3.离心机中对称放置； 4.接通电源前确认速度旋钮是否归零，调节定时旋钮设定时间，按开始键开始离心，缓慢调节速度至实际需要速度。 思考题 1.为什么测定嘌呤碱而不是嘧啶碱？ 2.为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？ * * 磷酸 碱基 戊糖 墨绿色 材 料 干酵母 一.提取步骤改动： 5g酵母中加入30 ml 0.04M NaOH，在研钵中研磨均匀，转入大试管，沸水浴20 min，3000转离心10min，取上清，弃沉淀。 上清液慢慢倾入10 ml 酸性乙醇中，边加边搅，静置沉淀RNA后， 3000转离心 3min，弃上清，取沉淀。 二. 鉴定 1.鉴定磷组分可适当增加，效果更好。 2.氨水过量太多也会使沉淀消失；先加硝酸银后加氨水效果明显。 苔黑酚显色的特异性较差，凡戊糖都有此反应。 准微量DNA无影响，较多DNA存在，亦有干扰。