聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang.pptVIP

实验目的 1、熟悉电泳的基本原理 2、掌握PAGE的基本原理与操作技术 具体安排 上午:制胶、原理讲解 中午：电泳（午餐） 下午：染色，脱色、观察结果 电泳的基本原理 电泳： 是指带电粒子在电场中向着与其所带相反电荷的电极方向移动的现象。 应用: 蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。 带电粒子的运动速度迁移率μ 影响电泳速度的因素 1、内在因素: 样品自身性质 2、外在因素: 电场 缓冲液 支持介质 v=QX/6πrη a. 电荷 b. 分子大小 c. 形状 电场（三要素） 电流： μ与电流成正比 电压： μ与电压成正比 常压电泳（100-500V） 高压电泳（500-10000V） 电阻： μ与电阻成反比 缓冲液 pH： 支持介质（物） 吸附:支持介质对样品的滞留作用,可导致样品的拖尾。 电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动。 当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动 速度；反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳 动速度。 分子筛：是凝胶电泳的一个特性。筛孔越小，则颗粒在 移动的过程中所受到的阻力也就越大。 电泳分类 按支持介质的不同可分为 ⑴ 纸电泳 ⑵ 醋酸纤维薄膜电泳⑶ 琼脂糖凝胶电泳 ⑷ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）⑸ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 分类（根据有无浓缩效应） 连续电泳： 电泳体系中缓冲液组成、pH值及 凝胶孔径大小都相同。 电荷效应、分子筛效应 不连续电泳：电泳体系中缓冲液组成、pH值 及凝胶孔径大小都不相同。 电荷效应 、分子筛效应、浓缩效应 不 连 续 电 泳 实验操作 一、制胶(本实验的关键步骤) 1、安装玻板： 将洗净的、带白色边条的玻板水平放好，将U型硅胶密封条摆好。然后，将不带边条的短玻板盖在U型硅胶密封条上。 分离胶的配制 灌注分离胶 另一小烧杯中按下列顺序加入：（D液有毒性，尽量不要接触到皮肤） 1——C液（Tris-HCl） 0.4 ml 2——D液（Acr-Bis） 0.8ml 3——E液(核黄素） 0.3 ml 4——过硫酸铵 0.6 ml 5——蒸馏水 0.9 ml 混匀 6——TEMED 1-2滴 轻轻混匀，快速倾倒进玻璃板间的缝隙,液面高度与矮板相平。 插入样品槽模板（又称梳子），不要带进气泡。 整个装置在紫外线下照射30分钟，使浓缩胶充分聚合（光聚合）。 每四组配制一份，再分装成4小份即可。 1——血清 0.3 ml （吸血清的吸量管用后要马上清洗，以免堵塞） 2——C液 1.0 ml 3——20%或40%的蔗糖 3.0 ml 4——0.05%溴芬兰 0.4 ml （思考2：为什么加2、3、4这三种液体？） 安装电泳槽,加入电极缓冲液（ F液） 加样:加样器针尖贴着高玻璃板伸到加样槽中间位置加样，针尖不要扎破下面的胶面。 加样量:10 ul -50 ul 1)加样完毕后，将电泳槽盖好盖，与电泳仪相连接。 2)电泳仪电压调至最大，电流调到最小，打开电泳仪开关进行恒流电泳。 3)浓缩胶:30mA(150V) 分离胶:40mA(200V) 加样后马上将微量加样器仔细冲洗多遍，以免血清堵塞针尖。 剥胶：拆开电泳槽装置，用竹镊子轻轻撬开两层玻璃板，戴上一次性手套，用手和镊子将分离胶剥离到染色液盘内，染色15分钟。 脱色： 将分离胶小心完整地从染色液中移到脱色液内，脱色三次，每次10分钟（每次更换新鲜脱色液80-100ml），脱色时在摇床上摇。 电泳 观察并记录电泳现象 八、剥胶、染色、脱色 * 实验九：聚丙烯酰胺凝胶电泳法  分离血清蛋白质 教 师：王丽华 即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。