chap10糖基化工程和糖生物学应用.pptVIP

糖生物学 第十章 糖基化工程 糖基化工程 糖基化工程的含义和意义 影响糖基化的因素 糖基化工程的手段 糖基化的监测 常用表达体系的糖基化特点 糖基化工程技术及其应用 Protein Market (2000) Biogenerics: expiry date of patent and market 贫血 贫血是指循环中红细胞的数量和血红蛋白浓度低于正常值，不足以维持血液组织正常氧和作用的代偿机制病症。最常见的是缺铁性贫血、再生障碍性贫血、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血等。 治疗 (Pre-1989): 红细胞疗法（输血，连同维生素和矿物质）。 问题: 对某些贫血不太有效。 Erythropoietin，EPO 美国Amgen’s 于1989年开发了Epogen（recombinant human erythropoietin，rhEPO） 促红细胞生成素 (erythropoietin, EPO) 水平在经历了化学疗法的癌症患者体内很低（尤其是肾衰竭者）。EPO可以刺激红细胞的生成， 并具有神经保护剂功能。 适应症: 红细胞生成不足引起的贫血 (来自肿瘤化疗、AIDS、慢性肾衰竭等) Erythropoietin Drug development N-linked glycans on EPO Different Biotech Formulation Some hrEPO’s with varying sites of glycosylation (a post-translation modification of protein) outlast others. Amgen’s Biotech Business Amgen的两大拳头产品： erythropoietin Epogen (epoetin alpha) colony stimulating factor Neupogen (filgrastim). 继Epogen后开发的新一代EPO产品仍是市场领军者： Aranesp (darbepoetin alpha) ：增加了两个Asn，使每分子EPO的唾液酸基团数量增加到22个。 Neulasta (pegfilgrastim)：对Neupogen进行PEG化修饰 重组表达的药用糖蛋白 世界生物医药市场主要品种大多为糖蛋白：rhEPO、GM-CSF、tPA等。全球产值约数百亿美元。 糖蛋白中的糖链对于药物在体内的稳定性、活性、靶向性及药代动力学有显著的影响，因此在开发这类药物时控制其糖基化具有较大的重要性。大多数情况下，对产品的糖基化必须予以优化和质量控制。 唾液酸化程度对EPO活性的影响 天然的和重组的EPO含有三条唾液酸化的复杂型N-糖链。 唾液酸化程度对EPO的体内半衰期有很大影响。 培养基pH、前体或营养成分的可利用性、不同细胞因子和激素的存在、细胞株中糖基转移酶和糖苷酶活性的强弱等因素均能影响培养细胞产物糖基化程度、分支程度、唾液酸化程度、硫酸化程度等。 酶替代疗法中溶酶体酶的靶向 溶酶体贮积性疾病 Gaucher`s disease（葡萄糖脑苷脂酶缺陷）的酶替代疗法需要通过细胞表面的Man受体靶向到巨噬细胞的溶酶体。 可由哺乳动物生成的含有N-聚糖的酶经糖苷酶（唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶等）降解产生。 也可由杆状病毒-昆虫细胞表达系统加工生产。 糖基化工程的目的 控制蛋白质上的寡糖链加工，使其 增加合成及分泌的效率 增加溶解度 延长体内半衰期：如rhEPO的Sia基团 增强对抗蛋白酶的稳定性 增加生物活性 降低抗原性 靶向导入：如在酶替代疗法中溶酶体酶的靶向 有助于蛋白质的纯化等 影响糖基化的因素 多肽链自身结构 潜在糖基化位点的分布和数目 蛋白质的空间结构 宿主系统糖基转移酶的表达 细胞培养的环境条件 糖基化工程的手段 体内控制 利用不同表达系统的糖基化差异 利用基因工程改变肽链上的糖基化位点 与GPI信号肽融合表达 重组表达糖基转移酶和糖苷酶等 体外修饰 利用天然的和合成的糖基化抑制剂 利用糖苷酶切除不需要的糖基 体外合成糖链 精确控制培养条件 常用表达系统的糖基化差异（一） 原核表达体系： 对重组蛋白不能糖基化 真核表达体系： 酵母： 酿酒酵母：过度甘露糖基化。需进行改造。 甲醇营养型酵母：Pichia pastoris; Hansenula polymorph：与哺乳动物接近 丝状真菌：表达异源蛋白比较困难 酵母表达产物的糖型 常用表达系统的糖基化差异（二） 昆虫细胞/杆状病毒： 应用广泛的真核表达体系。但其生产的重组糖蛋白一般仅具有高甘露糖或寡甘露糖型糖链，难以生成复杂型糖链成为该系统的缺陷之一。 转基因植物：表达哺乳动物糖蛋白具有较高免疫原性 哺乳动物细胞： 广泛应用的CHO细