基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力.pptVIP

Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌  细胞肺转移能力 立项依据 　 Akt1是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，可通过磷脂酰肌醇３激酶(PI3K)依赖的机制被胞外信号激活。目前发现Akt有三个家族成员Akt1／PKBα、Akt２／PKBβ、Akt３／PKBγ。它们的氨基端含有１个血小板－白细胞ｃ激酶底物同源结构区域(PH)可介导脂质—蛋白质和（或）蛋白质—蛋白质之间的相互作用。Akt通过ＰＨ区特异性与PI3K的类脂产物磷酯酰肌醇3,4,5-三磷酸结合募集到细胞膜上，并通过上游磷脂酰肌醇依赖性激酶1,2(PDK1、PDK2）磷酸化进入活化状态。激活的Akt重新定位到胞质、核内或细胞内的其他部位，磷酸化大量的底物蛋白，最终调节细胞的增殖、分化、存活和迁移等。 近年来研究发现，Akt1不但影响肿瘤细胞的增殖、凋亡，而且对许多肿瘤的侵袭和转移也有影响。Akt1基因在人胃癌中表达增加；活化的Akt1促进人类胰腺癌细胞、纤维肉瘤细胞和成纤维细胞的侵袭能力，但可抑制MDA-MB-2３１细胞的迁移能力。在乳腺癌中也发现Akt1异常表达和活性改变，并在乳腺癌的转移过程中发挥重要的作用。降低Akt1水平抑制Erb-2介导的乳腺癌体内转移；而过表达myr-Akt1可抑制人乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。Akt1活化还可促进Erb-2介导的乳腺肿瘤发生但抑制其侵袭能力。这些结果表明，Akt1在不同的细胞型或肿瘤的不同发展阶段所起的作用也不同。 研究目标和内容 作为一种原癌基因,Akt1在许多人类肿瘤中表达显著增高，促进肿瘤转移；但也有研究表明， Akt1的活化可抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。为了深入探讨Akt1在肿瘤发生发展过程中的作用，采用RNA干扰技术沉默了高转移小鼠乳腺癌细胞4T1中Akt1的表达。MTT法检测发现,Akt1沉默不影响4T1细胞的增殖能力。Tr-answell法检测证明,Akt1沉默可降低4T1细胞的迁移能力。与以上结果相一致,Akt1沉默不影响乳腺癌形成原位瘤的能力，但显著降低其体内肺转移能力。结果表明,Akt1在小鼠乳腺癌细胞转移过程中发挥重要作用，并提示Akt1可能成为乳腺癌治疗的靶点。 计划和方案设计 一、细胞株与培养基 小鼠乳腺癌细胞株4T1 细胞培养用培养基为DME-10培养基 培养环境为37℃培养箱，饱和湿度,5%CO2,0.25%的胰 -酶0.02％EDTA消化传代细胞。 二、Akt1干扰载体的构建 慢病毒载体plko.1-puro质粒与已设计好的干扰序列 Akt1-1、Akt1-2和小鼠已知基因无同源性的DNA干扰序列为阴性对照（表1)合成的寡核苷酸退火形成双链DNA片断，克隆到U6启动子下游的EcoRI和AgeI酶切位点(EcoRI和AgeI酶切位点之间原先存在约1800bp的无关DNA片断），转入大肠杆菌DH5α。EcoRI和AgeI双酶切筛选得到阳性克隆pLKO.1-siAkt1-１,pLKO.1-siAkt1-1-2和pLKO.1-Control,并测序验证。 三、Akt1沉默细胞株的构建:用磷酸钙法转染HEK293T细胞并经过嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞株4T1-siAkt1-1、4T1-siAkt1-2和对照细胞株4T1-control. 四、定量PCR和免疫印迹分析 五、MTT法检测细胞增殖活性:分别将对数生长期的３组乳腺癌细胞4T1-Control,4T1-siAkt1-1和4T1-siAkt1-2用0.25%胰酶消化,DMEM配制成单细胞悬液,接种于96孔板中,每组６孔,每孔约1×104个细胞，体积100μl, 置于5%CO2,37℃培养48h。每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml),37℃孵育4h,吸出培养基上清，150μlDMSO充分溶解。酶标仪测定吸光度(A)(测定波长570nm，参比波长630nm)实验重复３次。 六、Transwell法测定细胞迁移力 　 实验中采用6.5mm直径,10μm厚度,8μm孔径的聚碳酸酯多孔滤膜。取对数生长期细胞，胰酶-EDTA消化收集细胞，离心(1000r/minx5min)弃上清,血清DMEM洗涤１次，加入无血清DMEM，细胞计数，用无血清培养基重悬细胞至5x105个细胞/ml；上室每孔加入10μl细胞悬液,下腔室中加入600μl含Fn的培养基,37℃培养箱中培养24ｈ；取出Transwell并用PBS洗３次，5%戊二醛4℃固定0.5h；PBS洗３遍，加入结晶紫(0.1％)室温染色0.5h；PBS洗３遍，用脱脂棉擦去上表面细胞，显微镜下观察，取５个视野照相，