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第二章 细胞生物学的研究方法 第一节 显微镜技术 表一、几种介质的折射率 （六）共聚焦激光扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 二、电子显微技术 以电子束作为光源， 波长短，分辨率高 电子显微镜分辨率 理论值：0.002nm 实际值：0.1nm 电镜下观察到的结构称为超微结构或亚显微结构 （二）扫描电子显微镜SEM 第三节 细胞组分的分离 本章重点 如何提高显微镜的分辨率 熟悉各类光学显微镜的特点 光镜与电镜的区别 细胞培养的相关概念 差速离心分离细胞组分，各组分的沉降顺序 细胞分离方法 离心方法 流式细胞术 免疫磁珠法 激光捕获显微切割技术 (一)离心方法 利用细胞的密度特性可有效分离不同的细胞。 如血浆白细胞和红细胞的分离。 二、细胞培养 细胞培养(cell culture)：从机体中取出组织或细胞，模拟体内的生理环境，使之能够继续生存、生长和增殖的一种方法。 1.条件 ⑴ 营养条件： 培养基：RPMI-1640、DMEM。 血清。 ⑵ 5%CO2 ⑶ 无菌环境 2.细胞培养的主要方式是原代培养和传代培养 原代培养（primary culture）：直接从体内获取的组织和细胞进行的首次培养。 传代培养（secondary culture）：原代培养的细 胞经过增殖达到一定密度后，将细胞分散，从一个培养器以一定比例移到另一个或几个容器中的扩大培养。 3.来源于体内的细胞可在体外建系（细胞系） 细胞系（cell line）：在培养的细胞中产生“不死”的 变异细胞，这种细胞可以无限繁殖、传代。 细胞系的来源 取材于肿瘤组织的原代培养细胞（Hela细胞系） 培养过程中发生转化的正常细胞 细胞株（cell strain）：用细胞克隆化的方法进一步改 善细胞系的均一性，即分离出单个细胞使之增殖 形成的细胞群。 单克隆抗体技术 正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。 一、细胞裂解 在细胞组分分离前，首先破碎细胞，制备细胞裂解液 方法： 低渗透压； 超声振荡； 强制通过微孔； 机械破碎及研磨； 反复冻融 沉降顺序：细胞核——线粒体（混有少量溶酶体与过氧化物酶体）——微粒体（主要是内质网，少量高尔基体）——核糖体。 二、细胞器及细胞组分的分级离心 (一)差速离心 （differential centrifugation） 方法：从低速到高速逐级沉降。 分离对象：体积、质量差别较大的颗粒 。 匀浆 离心 1 000g 20分钟 细胞核 线粒体等 离心 15 000g 120分钟 微粒体 离心0.26%脱氧胆酸钠 15 000g 20分钟 核糖体等 离心 20分钟 10 000g 差速离心法 * * * * * * 一、光学显微镜技术 二、电子显微镜技术 表二、不同光线的波长 (二)荧光显微镜: 荧光：特定物质可以在紫外线激发后，发射出更长波长的可见光，即荧光。 暗背景，强反差，彩色图像 （荧光染料） 荧光分子：在激发后可发射荧光的物质即荧光分子 。 （由于荧光分子可以使被检样品呈现不同的染色，因此可做荧光染料用, 荧光分子也可以称作荧光染料。） 荧光显微镜的应用 定性、定位和定量的研究组织内的荧光标记物质。 对活细胞内分子的动态变化进行实时观察。 活细胞的微细结构和变化、分裂和运动等。 相差显微镜观察培养中的HeLa细胞 (四)暗视野显微镜通过散射光成像 应用：分辨率不高。 用于观察未经染色、无色透明的物体的轮廓和运动以及活细胞的质膜、纤毛、细胞核等结构。 原理：散射光成像。 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本散射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 (五)显微电影摄影技术记录细胞或细胞器的运动过程 原理：用显微电影摄影术或电视录像以一定时间间隔拍摄。 应用：准确记录细胞或细胞器的运动过程和速度。 特点： 高清晰 可形成被检物体的三维图像 结构： 普通荧光显微镜（a）与激光共聚焦显微镜（b）的成像比较