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重组基因导入到受体细胞 生物与食品工程学院 受体细胞 能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。 受体细胞应具有的特性： 1. 便于导入 2. 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中 3. 便于筛选 4. 密码子使用没有明显的偏倚 5. 安全性高 并不是所有的细胞都可以用来做受体细胞 原核受体细胞 1. 没有核膜 2. 基因组简单 便于对引入的外源基因进行遗传分析 3. 容易获得一致性的实验材料 单细胞 原核受体细胞 大肠杆菌（E.coli） 优点： 1. 研究背景清楚 2. 繁殖迅速培养简单 缺点： 1. 可引起人体致病 2. 缺少加工后修饰 目前商品化的基因工程产品多数是大肠杆菌生产的 人胰岛素、生长素、干扰素 原核受体细胞 枯草芽孢杆菌 能将基因表达产物分泌到培养基中 一般可表达真核蛋白 无致病性 可以形成芽孢，方便培养和保存 原核受体细胞 蓝细菌 含叶绿素，能进行光合作用，营养要求低。 基因组简单，遗传背景清楚。 可以成为植物基因表达的宿主。 真核受体细胞 酵母菌 结构最为简单的真核生物，背景清楚 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统 使用历史悠久，不产生毒素，安全有保障 培养简单 能将外源基因表达产物分泌到培养基中 真核受体细胞 植物受体细胞 有细胞壁，但可通过纤维素酶降解 原生质体在特定条件下培养，可再生细胞壁，进行细胞分裂。 植物细胞具有全能性，可以通过一个细胞培养出稳定的植株。 真核受体细胞 动物受体细胞 全能性较差，多采用胚胎细胞作为受体细胞。 优点： 能识别内含子 有翻译后加工修饰功能 真核受体细胞 人体胚胎干细胞（Stem cell） 高度未分化的细胞，是受精卵分裂到囊胚时的细胞，具有体外培养无限增殖和多向分化的特性。几乎可以被诱导成所有的细胞类型。 出于社会伦理的原因，一些国家禁止人类胚胎干细胞的研究。 转化 转化：重组DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 是一种自然现象 感受态 感受态：细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 细胞培养与收集 CaCl2处理 50~100mmol/L CaCl2,10mmol/L Tris-HCl, PH8.0,冰水浴15min。 转 化 革兰氏阳性菌转化过程 1. 细菌感受态的形成。受体细胞分泌激活蛋白，使细胞壁部分溶解，暴露细胞膜上的DNA结合蛋白。 2. 细胞膜上的DNA结合蛋白等因子激活核酸酶，降解DNA分子的一条链，将另一条链转入到受体菌内部。 转 化 革兰氏阳性菌转化过程 3. 单链DNA与其保护蛋白结合，转移到受体菌染色体DNA处。 4. 单链DNA同源重组到受体菌染色体 5. 转化子形成。 DNA转化感受态细胞 在感受态细胞中加入缓冲液和DNA，1小时以上，期间轻摇几次。 迅速转移至42摄氏度水浴2min，促使感受态吸收DNA分子。 转移到37摄氏度温浴5min，加入LB培养基 筛选转化子 转化率及其影响因素 转化率 1. 转化子数/用于转化处理的DNA分子数 2. 转化子数/受体细胞数 转化率及其影响因素 影响转化率的因素 1. 分子质量小，转化效率高 大于30kb的重组质粒很难进行转化 2. 载体类型 闭合双螺旋DNA要比线性DNA转化率高 对细胞亲和性强的载体转化率高 3. 重组DNA分子的浓度与纯度 转导 转导：病毒感染细胞并将外源DNA分子导入到受体细胞并稳定遗传的过程。 具有感染能力的噬菌体颗粒 重组DNA 头部蛋白、尾部蛋白 转染 转染：将重组的 λ 噬菌体DNA直接导入受体细胞的过程。 效率很低 辅助噬菌体对受体细胞预感染，提高转染率，但会给操作带来很多不方便 实际操作中很少使用 电激穿孔 原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上形成可逆瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。 电压增高和作用时间延长，有助于提高转化率，但细胞存活率降低。 三亲本杂交 基于非结合型质粒的迁移作用而建立的一种转化方式。 接合型质粒、非接合性质粒 将接合质粒转移到含有重组质粒的供体细胞中，然后将供体细胞与受体细胞混合，促使转化。 三亲本：受体菌、含重组质粒的供体菌、含有结合型质粒的辅助菌。 重组DNA分子导入酵母细胞 聚乙二醇（PEG）/乙酸锂 乙酸锂可使酵母细胞产生短暂的感受性状态。 PEG可以在高浓度乙酸锂环境中保护细胞膜，减少乙酸锂对细胞膜的过度损伤，同时促进质粒与细胞膜的结合。 重组DNA分子导入酵母细胞 用溶菌酶剥去酵母菌的细胞壁，形成原生质体。 酵母细胞壁主要由D-葡聚糖和D-甘露聚糖两类多糖组成，含有少量的蛋白质、脂肪、矿物质 Thank You