第三节 蛋白质的稳定化如何防止酶的可逆伸展.ppt

第三节 蛋白质的稳定化 如何防止酶的可逆伸展 一旦酶发生可逆伸展，如何防止其不可逆失活发生。 方法： 固定化 非共价修饰 化学修饰（共价修饰） 蛋白质工程 一、固定化 几种酶固定化方法对酶固定化后的示意图 (a)用双功能试剂交联；(b)共价或非共价偶联于载体上；(c)包埋到载体中。 1．空间障碍： 使得其它大分子难于与酶接近和作用，可以防止蛋白 水解酶和酶抑制剂的作用。同时，还可以防止化 学失活； 2．分配或扩散限制： 酶被固定化后，尤其是用包埋法固定化时，底物必须 先扩散到载体表面，然后才能进入到内部与酶作用。 此时，由于扩散限制使得反应速度对酶浓度的依赖性 减弱，而对底物的获得依赖性增强，使得酶的“稳定 化”程度增加； 3．抑制酶的自降解： 固定化可以使得酶的构象更加坚牢，从而阻止酶构象 从折叠态向伸展态过渡。 二、非共价修饰 1．反相胶束： 反相胶束示意图 反相胶束是酶和表面活性剂在与水不相混溶的溶剂中所得到的一种酶分子形式。它不仅可以保护酶，还能提高酶活力，改变酶的专一性。 2．添加剂 ①专一性的底物和配体（如酶反应的底物和产物、变 构效应剂、辅酶或辅酶的衍生物等）：与酶紧密结 合，使天然酶 伸展酶之间的平衡向天然酶方向移 动，从而更好地抵抗变性作用。 ②非专一性的中性盐：稳定蛋白质表面的疏水基团。 ③多羟基化合物（甘油、糖和聚乙二醇）：与蛋白质形 成大量氢键。同时，还通过对蛋白质的有效脱水，降 低蛋白水解作用。 ④与酶失活剂竞争的物质或除掉能引起酶化学催化反应 的物质，如螯合剂，还原剂等。 3．蛋白质间非共价相连 ①蛋白质间的非共价相连可以从蛋白质表面相互作用区 域排除水而降低自由能，增加蛋白质的稳定性； 盐 键 疏水相互作用 ②用抗体保护酶 有些抗体可以在蛋白质伸展的部位或发生蛋白质水解 的部位起作用。此外，抗体保护的酶还有抗氧化、抗 有机溶剂、抗低极端pH、抗自溶以及抗蛋白质水解作 用。 （三）化学修饰 1．可溶性大分子修饰酶 ①可溶性大分子如聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、肝素 等多糖以及白蛋白、多聚氨基酸等，可通过共价键联 结于酶表面，形成一个覆盖层。从而降低或消除其抗 原性、提高抗蛋白水解能力、增加其稳定性、延长其 半寿期。 ②大分子修饰剂可能会修饰酶的活性部位，使酶失活。 所以必须事先了解酶活性部位结构，或采取必要的措 施，保护酶活性部位。 2．可溶性小分子修饰酶 ①修饰有时会获得不同于天然蛋白质构象的更稳定构 象； ②由于修饰“关键功能基团”也会达到稳定化； ③由化学修饰引入到蛋白质中的新功能基可以形成附 加氢键或盐键； ④用非极性试剂修饰可加强蛋白质中的疏水相互作用； 位于蛋白质表面的很多疏水残基常聚集形成表面疏水 簇。如果待修饰的残基位于这类疏水簇附近，那么具 有适当链长的修饰剂就会与疏水簇靠近、接触。因 此，由于附加的疏水相互作用而增加蛋白质的稳定性。 Illustration of the main driving force behind protein structure formation. In the compact fold (to the right), the hydrophobic amino acids (shown as black spheres) are in general shielded from the solvent. 疏水稳定化的最有效的机理应当是在蛋白质的疏水核 内引入非极性修饰剂。 蛋白球体内部修饰法 蛋白质分子先伸展，然后在3种不同条件下重新折叠成具有催化活力的稳定的酶。 ⑤蛋白质表面基团的亲水化。 3．交联酶晶体(cross-linked enzyme crystals, CLECs) ①制备：用交联剂交联酶的微晶体(1～100 μm)而得 到的一种高度活化的固体 微孔材料。具有溶剂可填 充的直径1.5－10 μm的 均一通道。这些通道贯穿 整个晶体。 ②稳定化机理 a.蛋白水解酶或大分子抑制剂不能进入晶体通道； b.交联本身增加了晶体结构的稳定性，阻止蛋白质的伸 展，进一步稳定蛋白质； c.交联还增加了晶体的机械强度，可以