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SAGE技术在基因表达谱研究中的应用 上海华冠生物芯片有限公司 (国家人类基因组南方研究中心) SAGE技术的理论基础 首先，一段来自于任一转录本特定区域的“标签” (Tag)，即长度仅10～14bp的短核苷酸序列，就已包含了足够的信息以特异性地确定该转录本。 例如：一个10碱基的序列能有410=1048576种不同的排列组合，而人类基因组据估计仅编码80000种转录本，因此在理论上每一个10碱基标签就能够代表一种转录本的特征序列。 SAGE技术的理论基础 将短片段两两随机配对，形成双标签体 (Ditag)，在标签的种类、数量极大丰富的情况下，完全相同的双标签体出现的概率趋近于零。 将这些双标签体相互连接、集中形成长的DNA分子，对其进行测序将能得到大量连续的单个标签，并能以连续的数据形式进行处理。这样就可对数以千计的mRNA转录本进行批量分析。而在数据处理时将重复出现的双标签体剔除，即可避免由于PCR反应的非均一化扩增而引入的数据偏差；同时，各转录本的表达水平也就可以用特定标签被测得的次数来进行精确定量了。 SAGE技术的实验流程 SAGE技术的实验流程 相关技术的比较 SAGE技术的应用 正常细胞或组织基因表达谱研究 疾病相关基因表达研究 染色体表达图谱绘制 基因功能研究 药物作用机制的研究 毒理学研究 寻找新的基因 SAGE技术的应用 Owing to the low level of expression, the novel transcripts are difficult to identify using the EST approach but they have been detected as novel SAGE tags using the sensitive SAGE technique. And 65％ of them are derived from novel transcripts. Certification: The error rate for SAGE tags is 2% per tag. These novel transcripts are not only present in some rare cell types but also in many common tissues. The majority of genes in the human genome are expressed at low levels. * New opinion (by San Ming Wang, 2003) SAGE技术的优点和缺点 较全面获取生物的基因表达信息， 对基因序列没有选择性 所需的样品量极少 (100 ng mRNA) SAGE技术具有较好的重复性 发现新基因 设备简单 同表达谱芯片技术具有互补性和挑战性 成本较高，方法较复杂 10 bp序列表征基因尚有缺陷 SAGE技术的发展 鉴于SAGE文库中的Tag序列仅10个碱基，即使加上4个碱基的特定锚定酶切位点也就共14个碱基，在实际研究工作中其特异性尚有欠缺、包含的信息量较少，不便于后续工作，因此其相应的补充性、改良性技术也颇引人注目： GLGI技术： 即Generation of Longer cDNA fragments from SAGE tags for Gene Identification，通过PCR技术将10碱基的SAGE tag延伸至平均约250bp长的3’EST序列，用于验证SAGE结果、以及对未知基因的进一步研究。 SAGE技术的发展 LongSAGE技术： 即通过改变限制性内切酶及其相应的DNA识别位点，将普通SAGE tag的（10＋4）长度扩大至（17＋4），这样其特异性相应提高，且可作为探针直接从cDNA文库中筛选出带有目标基因的克隆。其不足之处在于：测序量和成本亦相应提高。 SAGE分析软件 SAGE结果分析 SAGE结果分析 SAGE结果分析 SAGE结果分析 本公司SAGE技术服务项目现况 目前，国内首家能够进行成熟而稳定的SAGE技术服务市场化运作的企业。 现有的客户主要为中国科学院上海生命科学研究院下属成员单位以及张江高科技园区内的一些科研单位。 已有20余个SAGE及1个LongSAGE案例的成功经验，样本涉及下列多个物种的群体、个体、胚胎，器官、组织和细胞等： 人（Homo sapiens） 大鼠（Rattus norvegicus） 小鼠（Mus musculus） 家蚕（Bombyx mori） 水稻（Oryza sativa） 棉花（Gossypium hirsutum） 油菜（Brassica nap