高效液相色谱HPLC基本原理课件.pptVIP

高效液相色谱HPLC基本原理;1） 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g, 荧光检测器—10-11g。 2） HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。;极性增加;二、 HPLC仪器 HPLC仪器包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统; 此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。 其工作过程如图所示。;He;1. 高压输液系统 1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔径约2 ?m，可防止颗粒物进行泵内。;2）溶剂脱气系统： 为什么需要脱气 防止在检测器中产生气泡，引起噪音。 除去氧气的影响。 超声波脱气 真空加热脱气 He气鼓泡脱气 在线脱气机脱气 溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。;;在线真空脱气和He脱气对保留时间在现性的影响;3）泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。 输液泵种类：恒压型和恒流型。 恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。 恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。;串联泵 单元泵原理;单元泵工作原理;溶剂传输系统工作原理;4）梯度洗脱装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。;低压梯度;高压梯度;;2. 进样系统 进样装置包括两种： 1）手动进样器：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。;To;;2）自动进样器;工作原理;;3. 色谱柱 1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为： 平衡密度法： 即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等； 非平衡密度法： 当采用粘度较大的试剂，如CC4，CH3OH, 丙酮，二氧杂环已烷、THF等。 填充方法： 填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。;0.090 in.;柱温箱;;;;;4. 检测器 液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。 1）紫外检测器 其检测原理和UV-Vis方法一样。只是，此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm, 体积约为1~10 ?L。 HPLC分析中，约有80%的物质可以在254 nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。 在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。;Lamp ;Tungsten lamp;Time;;;Take peak spectrum;2）荧光检测器 许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧