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核酸的光谱学和热力学特性 要点 核酸的紫外光吸收 DNA的纯度 核酸定量 减色效应和增色效应 热变性及复性 核酸的紫外吸收 减色效应 单一核苷酸RNA和ssDNAdsDNA,这种dsDNA相对于ssDNA吸收值减少的现象就成为减色效应。 dsDNA吸收值之所以最少，是由于碱基在疏水环境中的堆积所造成的。 　　　在研究核酸、核苷酸、核苷及碱基时，可以此对核酸进行定性及定量分析。另外，紫外线照射可引起DNA突变，也是由于存在于DNA中的核苷酸吸收紫外光所造成的。 OD260的应用:核酸定量 1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50 ?g/ml双链DNA 40 ?g/ml单链DNA（或RNA） 20 ?g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 核酸定量 在研究核酸、核苷酸、核苷及碱基时，可以此对核酸进行定性及定量分析。 DNA纯度 dsDNA的A260/A280=1.8 RNA的A260/A280=2.0 蛋白质的最大吸收峰为280nm 如果A260/A2801.8,说明有RNA污染。 如果A260/A2801.8，说明有蛋白质污染。 溶解性： RNA和DNA是极性的化合物都微溶于水不溶于乙醇乙醚、氯仿等有机溶剂。 在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。DNA核蛋白(DNP)与RNA核蛋白(RNP)的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。 DNP溶于水和浓盐溶液，在1mol/L的NaCl溶液中溶解度比纯水高2倍，但在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，仅为水的1%，几乎不溶解； RNP在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L的NaCl溶解度较大。因此，在核酸的提取中，常用此法将两种核蛋白分开，然后用蛋白质变性剂去除蛋白质。 核酸的热变性与复性 变性（denaturation） 核酸的变性是指核酸的互补配对碱基之间的氢键断裂，而构成磷酸-戊糖骨架的3,5-磷酸二酯键并未发生变化。 温度升高，溶液的盐浓度降低，或者溶液的酸碱度改变，都可以使核酸发生变性。实验室中最常用的使DNA分子变性的方法之一是加热。DNA分子的变性可以导致 A260增加。 RNA随温度升高碱基堆积会逐渐减少，光吸收值会逐渐地、不规则地增大。 dsDNA升温过程中，分子末端及内部富含A-T的区域的变性将会使其附近的螺旋变得不稳定，从而导致整个分子结构在一个确定的温度共同变性，这一温度取过渡期的中点值，称为解链温度（melting temperature），以Tm表示。 Tm值计算公式为： Tm＝69.3+41(G+C)% 少于20个碱基的寡核苷酸的 Tm＝4(G+C)+2(A+T)  * * 嘌呤(purine) 腺嘌呤(adenine, A) 鸟嘌呤(guanine, G) 嘧啶(pyrimidine) 胞嘧啶(cytosine, C) 尿嘧啶(uracil, U) 胸腺嘧啶(thymine, T) 嘌呤环和嘧啶环中含有共轭双键，因而都有吸收紫外光的性质，吸收高峰在波长260nm左右。 变性引起紫外吸收值的改变 DNA的紫外吸收光谱 增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。