生化实验报告1.docVIP

南方医科大学 南方医科大学 生物化学实验报告 姓 名： 许梨梨 学 号： 3120100024 专业年级： 2013级医学影像学 组 别： 第3实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 氨基酸的薄层层析 实验日期 2014-10-24 实验地点 第3实验室 合作者 许琮 指导老师 何肖娟 评分 教师签名 批改日期 一、实验目的 1.掌握薄层层析法的一般原理。 2.掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 3.掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。 二、实验原理 （一）薄层层析法 薄层层析法是色谱分析技术的一种，一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液体（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而能够将样品各组分分离开。即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来。 吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基，这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。 本实验采用硅胶吸附薄层层析。硅胶吸附薄层层析的特点：1.硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。2.硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。3.硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。 （二）氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基酸，与此同时。还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。 （三）相对迁移率—Rf值的计算 混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 三、材料与方法： （一）实验材料 1.分析样品：（1）混合氨基酸溶液 （2）氨基酸的异丙醇溶液：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸。 2．试剂：（1）吸附剂：硅胶； （2）黏合剂：0.5%的羧甲基纤维素钠； （3）展层-显色剂：为正丁醇、乙醇、茚三酮、丙酮、蒸馏水混合液； 3.仪器及器材：（1）层析板（5*15cm）；（2）小烧杯及药匙；（3）量筒（10ml）； （4）小尺子和铅笔；（5）毛细玻璃管；（6）层析缸；（7）烘箱；（8）天平 （二）实验方法 1.实验流程： 比色 比色测定 调浆 调浆 标记点样活化干燥涂布 标记 点样 活化 干燥 涂布 显色层析点样制板 显色 层析 点样 制板 2.操作步骤 ： 制板①调浆：称取硅胶3.5克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8mL，调成均匀的糊状；② 制板 ①调浆：称取硅胶3.5克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8mL，调成均匀的糊状； ②涂布：取干净的干燥玻璃板均匀涂层； ③干燥：将玻璃板水平放置。室温下放置30分钟以上，自然晾干； ④活化：70℃烘干30min。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。 点样①标记：用铅笔在距底边2cm处画上条水平线，在线上均匀确定4个点并做好标记，每个样品间相距1cm。② 点样 ①标记：用铅笔在距底边2cm处画上条水平线，在线上均匀确定4个点并做好标记，每个样品间相距1cm。 ②点样：用毛细管分别吸取丙氨酸、精氨酸、甘氨酸及混合氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高2cm。轻轻接触薄层表面点样。加样原点扩散直径不超过2mm。点样后自然晾干，必要时重复加样。 显色层析 将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖（层析缸盖上涂上凡士林防止层析液挥发），上行展层。当展层剂前沿到达薄层板中间部分时，即可停止展层，取出薄板，用铅笔描出前沿界限。 将薄板置于烘箱中，在70℃烘干30分钟，即可显出各层斑点。 显色 层析 将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖（层析缸盖上涂上凡士林防止层析液挥发），上行展层。当展层剂前沿到达薄层板中间部分时，即可停止展层，取出薄板，用铅笔描出前沿界限。 将薄板置于烘箱中，在70℃烘干30分钟，即可显出各层斑点。 四、结果与讨论： （一）结果 1.实验现象 （1）层析时，能清楚地看到展层-显色剂在层析板上运动的痕迹。通过计时及观察展层剂前沿的位置